2022年8月，上海市農業(yè)科學院食用菌研究所趙妍研究員團隊在Journal of fungi(Basel,Switzerland)期刊（IF：5.724）發(fā)表了題為 “Comparative Proteomics Study on the Postharvest Senescence?of??”的研究成果，通過iTRAQ標記定量蛋白質組學研究方法，發(fā)現(xiàn)了草菇采摘前后衰老的一些相關生物學過程，探究草菇衰老過程的機理，為進一步研究草菇衰老機制提供了理論依據(jù)。

中文標題：草菇采后衰老的蛋白質組學比較研究

研究對象：草菇

發(fā)表期刊：Journal of fungi(Basel,Switzerland)

影響因子：5.724

發(fā)表時間：2022年8月

合作單位：上海市農業(yè)科學院食用菌研究所

運用組學技術：iTRAQ標記定量蛋白質組學

研究背景

衰老是果實發(fā)育的最后階段，伴隨著果實風味、果皮顏色、質地、病原體敏感性和生化成分的劇烈變化。食用菌采后衰老嚴重影響其商業(yè)價值。采后15 °C貯藏能夠提高草菇的貯藏品質，但要實現(xiàn)草菇的長途運輸、市場流通和最大商業(yè)價值，適宜的溫度是不夠的。

蛋白質組學可用來研究果實成熟過程中蛋白質組成和豐度變化以及采后處理對果實蛋白質組的影響。蛋白質組學技術的進步使研究人員能夠定量測量復雜樣品中的蛋白質組學變化。特別是，基于相對和絕對定量（iTRAQ）定量蛋白質組學的同量異位標簽已成為首選的有力工具，因為它們由于分子量、等電點或疏水性的限制而覆蓋多種蛋白質。同時，iTRAQ技術尚未用于評估15 °C下草菇的采后衰老。本研究選擇了四個時間點，即0，24，60和96 h，運用iTRAQ技術的比較蛋白質組學研究。從蛋白質組學的角度，揭示了草菇采后貯藏過程中蛋白質組在15 °C下的動態(tài)變化，為開發(fā)抑制草菇衰老的酶抑制劑提供了理論依據(jù)。

研究思路

研究結果

1.生理、表型和質構分析

結果表明，草菇在60-96 h硬度逐漸顯著（圖1A），在96 h時硬度最為顯著（圖1B）。草菇的結構在60-96 h相對于貯藏期開始時的結構發(fā)生了顯著變化。在24 h貯藏期間，草菇的外觀沒有明顯變化（圖1C）。隨著貯藏時間的增加，草菇表面出現(xiàn)褐變，并逐漸腐爛。這可能是由于草菇中水分的流失，細胞膜的破壞以及草菇采后貯藏期間自我調節(jié)的下降引起的。

圖1 | 不同貯藏期伏尾弧菌子實體硬度

（A）（B）脆性和（C）表型的變化。每個條形表示各個樣本的平均±標準誤差，* 表示p< 0.05。

2.DEP 的識別

對貯藏0、24、60和96 h采集的樣品進行基于iTRAQ標記定量蛋白質組學分析，了解15 °C貯藏過程中草菇的蛋白質組學變化。共鑒定了2063種可靠的蛋白質。圖2顯示了S24–S0，S60–S0和S96–S0中蛋白質的差異表達模式。如圖 3 所示，DEP 隨存儲時間的增加而增加。在 S24-S0 組中，鑒定出 54 種上調蛋白（圖 3 C）和 170 種下調蛋白（圖 3 B），共 224 個 DEP（圖 3A）。在 S60–S0 組中，共檢測到 160 個上調蛋白（圖 3 C）和 302 個下調蛋白（圖 3 C），共 462 個 DEP（圖 3A）。在S96-S0組中共鑒定出207種上調蛋白和356種下調蛋白（圖3B），共563個DEP（圖3A）。

圖2 | S24-S0，S60-S0和S96-S0之間的重疊DEP維恩圖。

每個發(fā)展階段下調（B）和上調（C）的DEP數(shù)量顯示在不同的圓圈中。

圖3?| 草菇S24–S0、S60–S0 和 S96–S0 中的DEP火山圖

以紅色（FC ≥ 1.5）和綠色（FC ≤ 2/3）突出顯示的點表示表達水平顯著不同的蛋白質（p≤ 0.05）。

3.?層次聚類分析

DEP的分層聚類分析更清楚地顯示了四個時間點之間蛋白質豐度的變化（圖4）。S0、S24、S60和S96的顏色變化顯著，表明4個時間點的蛋白表達水平變化顯著。S0、S24 和 S60 組之間顏色的顯著變化表明蛋白質表達的顯著變化。

圖4?| S24、S60和S96組與S0組草菇DEPs的聚類分析

與基線水平相比，紅色、綠色和黑色分別表示蛋白質豐度增加、減少和無變化。

4.DEP 的 GO 分析

GO結果表明，細胞過程、代謝過程、單生物體過程、細胞成分組織或生物發(fā)生、生物調控、定位、對刺激的反應、生物過程的負調控、生物過程的正向調控等過程對草菇在15°C貯藏期間的老化有重要影響（圖5（A-BP））。DEP 的數(shù)量隨著存儲時間的延長而增加。

一般而言，與0 h樣品中鑒定的蛋白質相比，DEPs含量隨著貯藏時間的延長而逐漸增加，參與生物過程、細胞成分和分子功能的DEPs含量逐漸增加。更具體地說，DEPs的內容分為細胞過程，代謝過程，單生物體過程，細胞成分組織或生物發(fā)生，生物調節(jié)，細胞部分，細胞器，細胞器部分，大分子復合物結合，催化活性，結構分子活性，轉運蛋白活性等隨著儲存時間的增加而增加，在生物調節(jié)和其他過程發(fā)揮了重要作用。

圖5?| 上述DEP在三個領域的GO術語的生物信息學分析

5.KEGG通路分析

對595個DEP進行了KEGG分析，以探索不同蛋白質的代謝途徑和功能。結果揭示了88種不同的代謝途徑，其中9種顯著改變。S24–S0、S60–S0 和 S96–S0 中的 DEP 均參與 RNA 轉運、α-亞麻酸代謝以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 （p< 0.05）（圖 6）。

此外，RNA轉運途徑在所有途徑中富集了最多的DEP。在S60–S0和S96–S0中，DEPs參與脂肪酸降解、過氧化物酶體、賴氨酸生物合成、核糖體和賴氨酸降解的途徑（p< 0.05），核糖體和過氧化物酶體途徑中富集的DEPs多于其他途徑。然而，只有一種蛋白質參與賴氨酸的生物合成和降解途徑。因此，RNA轉運、核糖體、過氧化物酶體、賴氨酸生物合成和降解途徑中的相關DEP是進一步討論的重點。

圖6 | S24-S0 （A）、S60–S0 （B） 和 S96–S0 （C） 中前 10 條富集 KEGG 通路的氣泡圖

6.DEP 之間蛋白質相互作用（PPI）的分析

PPI網(wǎng)絡（圖7）顯示，S60-S0（圖7B）和S96-S0（圖7C）組之間的KEGG途徑有許多相似之處，兩者都含有參與α-亞麻酸代謝的DEP;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成;核糖核酸轉運;脂肪酸降解;過氧化物酶體;和核糖體途徑。相比之下，S24-S0（圖7A）組與S60-S0和S96-S0組顯著不同。只有α-亞麻酸代謝;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成;這些群體的RNA轉運途徑重疊。

圖7?| PPI 網(wǎng)絡圖

相關討論

聚腺苷酸結合蛋白1（PAB1）、真核翻譯起始因子3亞基A 1（RPG1）、乙酰輔酶A羧化酶1（ACC1）、醇脫氫酶3（ADH3）、醇脫氫酶2（ADH2）、醛脫氫酶5（ALD5）和琥珀酸脫氫酶2（SDH2）（圖8）等DEPs在15 °C貯藏期間也參與了草菇老化途徑。RNA從細胞核到細胞質的轉移是基因表達的基礎。RNA轉運、核糖體和mRNA監(jiān)測途徑以及其他與轉錄相關的途徑參與了15 °C貯藏期間的草菇老化。核糖體功能下降，可能導致相關基因調控降低。脂肪酸組成的變化影響了細胞膜，這可能加速草菇的成熟和衰老。

研究結論

研究運用iTRAQ標記定量蛋白質組學描述了草菇采后15 °C儲存的衰老的機制。該機制可能與參與蛋白質合成和轉錄、脂肪酸合成和代謝以及氨基酸合成和代謝的DEPs的調節(jié)有關。此外，大多數(shù)RNA轉運相關蛋白被下調，這可能導致相關基因調控的降低。其他重要蛋白質的表達，如脂肪酸代謝相關蛋白質增加;脂肪酸組成的變化影響細胞膜，可能加速伏尾弧菌子實體的成熟和感知。

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