中國藥科大學(xué) 生物藥物分析 我也不記得第幾章 多糖類藥物分析
1、?? 來源分類:動物、植物、微生物、海洋生物。
2、?? 組成分類:均一多糖、不均一多糖、粘多糖:含氮的不均一多糖;結(jié)合糖:肽聚糖、脂多糖、糖蛋白和蛋白聚糖。
3、?? 多糖的理化性質(zhì):旋光性、硫酸蒽酮反應(yīng):(620nm),硫酸苯酚反應(yīng)(490nm),氨基己糖-乙酰丙酮(525nm),糖醛酸-硫酸咔唑(520nm)。
4、?? 多糖純度測定:(1)超離心法:單一區(qū)帶;(2)電泳法:單一色帶;(3)凝膠色譜法:單一洗脫峰;(4)旋光法:均一組分。
5、?? 多糖分子量測定:凝膠色譜法;粘度法;超離心法、HPLC。
6、?? 凝膠層析法:將分子量不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的凝膠固定相,由于各組分流經(jīng)體積大差異,使不同分子量的組分得以分離,最先淋出的是最大的分子。
7、?? 凝膠色譜法:sephadexG-200,多糖標(biāo)準(zhǔn)品,分部收集,硫酸苯酚檢測,分別求得洗脫體積Ve,Ve與1gM之間存在著線性關(guān)系,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測樣品上柱,待測多糖Ve,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測多糖分子量。
8、?? 粘度法:用已知結(jié)構(gòu)的相似的多糖決定K值,然后測出待測多糖的特性粘數(shù)n,計算待測多糖的分子量。
9、?? 超離心法:根據(jù)測得的沉降系數(shù)計算多糖的平均分子量。
10、???????????? HPLC測定分子量及分布:色譜條件:凝膠柱,示差折光檢測器。
11、???????????? 多糖含量測定:比色法(硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法);生物測定法(肝素鈉);生色底物法(低分子量肝素鈉)
12、???????????? 乙酰丙酮法——氨基己糖;原理氨基己糖在堿性條件下加熱,可與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物,該衍生物與對一二甲氨基苯甲醛反應(yīng),該反應(yīng)物呈紅色,與525nm測定吸收度。
13、???????????? 硫酸咔唑法測糖含量:在濃硫酸中,己糖醛酸與咔唑溶液反應(yīng)生成的反應(yīng)物呈紅色,520nm。
14、???????????? 硫酸苯酚法:多糖在濃硫酸作用下水解成單糖,該單糖在強(qiáng)酸條件下與苯酚反應(yīng)生成橙色衍生物,在490nm處有最大吸收,其吸光度與濃度呈線性關(guān)系。
15、???????????? 硫酸蒽酮法測定糖含量(總糖):原理:多糖在濃硫酸中水解后,進(jìn)一步脫水生成糠醛類衍生物,與蒽酮作用形成藍(lán)色化合物,620nm處進(jìn)行比色測定。
16、???????????? 肝素測定:美國藥典采用羊血漿法。既比較肝素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品延長血漿凝結(jié)時間的作用來測定肝素的效價。
17、???????????? 肝素、低分子量肝素生色底物法原理測定。當(dāng)?shù)鞍酌福‵XA)從生色底物分裂出pNA時,發(fā)色物的產(chǎn)生量與剩余的酶量成正比,與肝素效價成反比,405nm測定。
18、???????????? 多糖類藥物的結(jié)構(gòu)分析:單糖組成、糖苷鍵連接方式、糖苷鍵連接位置
19、???????????? 多糖組成單糖的分析:(1)水解方法;完全酸水解法,部分酸水解、堿水解、乙酰解、甲醇解、酶降解(2)鑒定。
20、???????????? 完全酸水解法:水解難易取決單糖性質(zhì)及構(gòu)型。己聚糖一般用1mol/L硫酸,70℃,8h。氨基葡聚糖為4mol/L鹽酸,100℃,9h。
21、???????????? 部分酸水解、堿水解法:選擇溫和的條件水解多糖,使糖鏈中某種類型的堿特異性地打斷。(3)乙酰解:多糖經(jīng)過乙酰解反應(yīng)(醋酐、冰醋酸),可生成乙?;瘑翁呛凸烟?。
22、???????????? 甲醇解:多糖鏈在80-100℃條件下與無水甲醇反應(yīng)能將糖鏈變成組成單糖的甲基糖苷。甲基糖苷能轉(zhuǎn)化為三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物,進(jìn)行氣相色譜分析。
23、???????????? 酶降解:分為外切糖苷酶和內(nèi)切糖苷酶。外切糖苷酶:切下多糖非還原末端的一個單糖,并對單糖組成和糖苷鍵,釋放多糖鏈片段以利于結(jié)構(gòu)分析。
24、???????????? 單糖的分離鑒定:氣相色譜法,hplc,氣質(zhì)聯(lián)用。
25、???????????? 氣相色譜法常用的衍生物有:三甲硅烷(TMS)衍生物、三氟乙酰(TEA)衍生物、乙酰(AC)衍生物,甲基衍生物。糖苷鍵連接方式的測定:(1)紅外光譜,確定吡喃糖糖苷鍵時,890cm-1處有特征吸收為β-糖苷鍵,840cm-1處為a-糖苷鍵。(2)核磁共振譜:化學(xué)位移5.4、5.1為a型糖苷鍵,4.53為β型糖苷鍵。
26、???????????? 糖苷鍵連接位置的確定:(1)高碘酸氧化,Smith降解、(2)甲基化反應(yīng)產(chǎn)物分析、(3)乙酰解后質(zhì)譜分析。
27、???????????? 高碘酸氧化:原理:選擇性的氧化降解反應(yīng),能夠作用于多糖分子中1,2-二羥基和1,2,3-三羥基,生成過碘酸氧化產(chǎn)物;此產(chǎn)物用硼氫化鈉還原后,再用酸水解,生成相應(yīng)的醛、甲酸,室溫下用稀無機(jī)酸水解還原產(chǎn)物。1,2連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原得到穩(wěn)定的多羥基化合物,再用稀鹽酸水解,得到甘油及甘油醛。1,3連接的糖苷鍵與高碘酸不起反應(yīng),經(jīng)還原與水解后得到原來的單糖。1,4連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原,用稀鹽酸水解得到最終產(chǎn)物為赤蘚醇和乙醇醛。1,6連接的糖苷鍵:得到甘油及乙醇醛。
28、???????????? 甲基化反應(yīng)產(chǎn)物分析:多糖經(jīng)甲基化作用使分子中的羥基甲基化,然后用甲酸和三氟醋酸水解,以氣相色譜鑒定甲基化水解產(chǎn)物。
29、???????????? 乙酰化后質(zhì)譜分析:多糖經(jīng)過乙?;磻?yīng)(醋酐、冰醋酸)生成乙?;瘑翁呛凸烟?。用氯仿抽提,蒸去氯仿,進(jìn)行質(zhì)譜分析。分子離子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰單糖碎片峰,表明有支鏈結(jié)構(gòu)。