作為生命活動的主要承擔(dān)者,蛋白質(zhì)的功能一直是科研活動中備受關(guān)注的明星。蛋白質(zhì)通常不是“單打獨(dú)斗”的,絕大多數(shù)的功能蛋白質(zhì)會與其他蛋白質(zhì)相互作用,一起調(diào)控生命過程。那么,研究蛋白質(zhì)互作的技術(shù),你了解多少呢?

一、免疫共沉淀

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,COIP)技術(shù)是利用抗原抗體之間具有特異的免疫結(jié)合的原理,在細(xì)胞裂解液中加入特異性抗體,將抗原及與抗原結(jié)合的蛋白沉淀下來。免疫復(fù)合物可以通過Western Blot的方法驗(yàn)證抗原和其他蛋白之間的相互作用,也可以用質(zhì)譜的方法,檢測抗原的結(jié)合蛋白成員。

免疫共沉淀

COIP技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn):

優(yōu)點(diǎn):

(1)得到的互作蛋白是細(xì)胞內(nèi)與誘餌蛋白天然互作的,符合體內(nèi)真實(shí)生理情況;

(2)實(shí)驗(yàn)條件溫和,可避免人為的影響;(3)可分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。

缺點(diǎn):

(1)不適用于結(jié)合力弱或者瞬間結(jié)合的蛋白互作研究。

二、Pull Down

Pull-down技術(shù)用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-),從細(xì)胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。通過Pull-down技術(shù)可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間的相互作用關(guān)系,從體外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關(guān)系。COIP檢測到的蛋白互作關(guān)系可能是第三個(gè)蛋白作為橋梁建立的,與之相比,pull down技術(shù)可用于檢測蛋白之間的直接互作關(guān)系。但pull down需要先把誘餌蛋白原核表達(dá)純化出來,再與目的蛋白溶液孵育,其無法像COIP一樣模擬細(xì)胞內(nèi)天然的互作環(huán)境。

Pull-down技術(shù)

三、雙分子熒光互補(bǔ)

雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)是指熒光蛋白多肽鏈在某些不保守的氨基酸處切開,形成不發(fā)熒光的N-和C-末端2個(gè)多肽片段。將這2個(gè)熒光蛋白片段分別連接到1對能發(fā)生相互作用的目標(biāo)蛋白上,在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)或體外混合這2個(gè)融合蛋白時(shí),由于目標(biāo)蛋白質(zhì)的相互作用,熒光蛋白的2個(gè)片段在空間上互相靠近互補(bǔ),重新構(gòu)建成完整的具有活性的熒光蛋白分子,從而產(chǎn)生熒光?？梢暬?BiFC 技術(shù)最大的特點(diǎn)。

雙分子熒光互補(bǔ)

四、酵母雙雜交

酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)研究的一種重要方法。其原理是當(dāng)靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后,誘餌蛋白結(jié)合于報(bào)道基因的啟動子,啟動報(bào)道基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),如果檢測到報(bào)道基因的表達(dá)產(chǎn)物,則說明兩者之間有相互作用,反之則兩者之間沒有相互作用。在實(shí)際工作中,人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。

除此之外,研究蛋白質(zhì)互作的方法還有噬茵體展示技術(shù)、等離子共振技術(shù)、抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù)等。選擇合適的實(shí)驗(yàn)方案會讓您的實(shí)驗(yàn)過程事半功倍,MDL,專業(yè)的技術(shù)平臺為您的實(shí)驗(yàn)助力。