干貨 | miRNA建庫方法大放送！哪一種是你的pick?
經(jīng)典的small RNA文庫構(gòu)建方法基于在miRNA的3’和5’端連接兩個(gè)測序接頭（Norgen、Lexogen和QIAseq的建庫方法），但是由于不平衡的連接效率會(huì)導(dǎo)致真實(shí)的miRNA水平產(chǎn)生嚴(yán)重的定量偏倚。為改進(jìn)miRNA定量的準(zhǔn)確性，發(fā)展出了3種miRNA的建庫方法。
第一種方法是使用帶隨機(jī)核苷酸片段的接頭去提高接頭的連接效率。（NEXTflex的方法)。
第二種方法是無需接頭連接，而是利用添加ployA并在反轉(zhuǎn)錄過程中進(jìn)行模版轉(zhuǎn)換（SMARTer的方法)。
第三種方法是依靠連接一個(gè)單端的3’接頭，然后進(jìn)行環(huán)化(RealSeq的方法)。
此外，在文庫構(gòu)建的PCR擴(kuò)增過程中也會(huì)增加定量的偏倚。為了降低PCR過程中的PCR偏倚，UMI被引進(jìn)用于識(shí)別和移除PCR重復(fù)（QIAseq的方法），但是這種方法在small RNA-seq中的效率是存疑的。此外，EdgeSeq平臺(tái)利用捕獲雜交探針和目的序列進(jìn)行數(shù)據(jù)的讀取，是一個(gè)在臨床中易用的設(shè)計(jì)，也是small RNA-seq的一種有效的改進(jìn)。本文選擇了7個(gè)代表當(dāng)前所有有效技術(shù)方法的small RNA-seq文庫構(gòu)建方法，比較了在人血漿樣品中miRNA的定量結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)方法
圖1A：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
本文選用3個(gè)健康人的血漿樣品進(jìn)行RNA的抽提，合并混合后進(jìn)行7個(gè)不同方法的建庫流程及測序分析。同時(shí)以miRXplore 通用參照作為陽性參照進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，它包含950多個(gè)等摩爾比合成的miRNA。每種方法均設(shè)計(jì)技術(shù)重復(fù)。建庫方法流程及循環(huán)數(shù)根據(jù)各自試劑流程進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 方法間的相關(guān)性比較
圖1B：miRXplore 和 plasma樣品在不同方法間的相關(guān)性熱圖
相關(guān)性數(shù)據(jù)表明每個(gè)方法的結(jié)果在方法內(nèi)都具有較高的相關(guān)性，而在方法間則相關(guān)性均較差。表明每種方法均會(huì)產(chǎn)生特異的技術(shù)偏倚。
2.2 不同方法的結(jié)果偏倚比較
圖1C: miRXplore樣品的準(zhǔn)確度。密度圖表明了檢測數(shù)據(jù)與預(yù)期數(shù)據(jù)間的差異倍數(shù)的分布。虛線表示期望值的兩倍差異，數(shù)字表示在兩倍差異內(nèi)外miRNA的百分比。
因?yàn)閙iRXplore 樣品中的miRNA數(shù)據(jù)是已知的，通過對(duì)miRXplore 樣品結(jié)果進(jìn)行了各方法偏倚程度的比較（圖1C）。結(jié)果表明EdgeSeq 和 SMARTer的方法有最小的數(shù)據(jù)偏倚，而Norgen 和Lexogen 的方法結(jié)果偏倚最大。
2.3 偏倚因素分析
圖1D: QIAseq 數(shù)據(jù)的偏差方差百分比
以往的研究表明接頭連接是造成結(jié)果偏倚的重要原因，PCR過程中產(chǎn)生的偏倚也是有爭論的。本文利用QIAseq的數(shù)據(jù)對(duì)miRXplore樣品進(jìn)行了所有結(jié)果偏倚因素的分析（圖1D），因?yàn)镼IAseq利用了UMI，能夠從其他因素中分離出PCR的偏倚影響。
結(jié)果表明連接偏倚的影響占比是最高的，而PCR引起的偏倚在整體上是可以忽略不記的。這個(gè)結(jié)果也與前面的結(jié)論一致（圖1C），無需接頭連接的EdgeSeq 和 SMARTer的方法有最小的偏倚，而基于連接的方法偏倚最大。
為了研究導(dǎo)致偏倚產(chǎn)生的原因，對(duì)miRXplore樣品中所有種類miRNA的特征進(jìn)行了分析（圖1E）。在RealSeq 和 SMARTer方法中，miRNA序列中的第一個(gè)核酸有較高的影響，分別貢獻(xiàn)了44%和25%的變異性。在基于雙端接頭連接的方法Lexogen、Norgen和QIAseq中，miRNA的最后一個(gè)堿基和接頭結(jié)構(gòu)的自由能對(duì)偏倚產(chǎn)生影響?？傊@些結(jié)果表明連接是small RNA-seq過程中數(shù)據(jù)偏倚產(chǎn)生的最大來源，它能夠被技術(shù)特異性及其他較多復(fù)雜因素影響。
圖1E: miRXplore 樣品中QIAseq 數(shù)據(jù)miRNA測序特征的方差百分比
2.4? RT-qPCR驗(yàn)證相關(guān)性
作者的數(shù)據(jù)也表明每種方法的的miRNA 結(jié)果都會(huì)產(chǎn)生各自的獨(dú)特?cái)?shù)據(jù)偏倚，然而這些結(jié)果是基于平均混合的miRNA的結(jié)果，并不能完全代表生物樣品中的真實(shí)情況，因此作者在血漿樣品中挑選了19個(gè)miRNA進(jìn)行RT-qPCR，分析了與RNA-seq結(jié)果的相關(guān)性。所有方法中的結(jié)果均表現(xiàn)出正相關(guān)，R2在0.53到0.88之間（圖1F）。與miRXplore的結(jié)果一致，Lexogen 和 Norgen的相關(guān)性也是最差的。作者探討了通過各方法特異的miRXplore結(jié)果來校正血漿樣品中RNA-seq數(shù)據(jù)的偏倚。圖1F為各方法內(nèi)的RNA-seq結(jié)果的相關(guān)性，圖1G為各方法間數(shù)據(jù)的相關(guān)性。結(jié)果表明，特異方法的結(jié)果偏倚在不同的樣品間是存在的，在扣除已知的背景值后，能夠使RNA-seq的值更加準(zhǔn)確，不同方法間能夠更好的進(jìn)行比較。
圖1F: 血漿樣品中small RNA-Seq 和RT-PCR (RT-qPCR) 定量結(jié)果基于miRXplore結(jié)果偏差校準(zhǔn)前后的相關(guān)性
圖1G:血漿樣品各方法間在miRXplore進(jìn)行校準(zhǔn)前后的可重復(fù)性。P 值用雙尾T檢驗(yàn)。QIAseq UMI 代表deduplication后的數(shù)據(jù), QIAseq 代表 non-deduplicated的數(shù)據(jù)
2.5? mapping統(tǒng)計(jì)
圖2A: miRXplore 和 plasma樣品的Mapping 統(tǒng)計(jì)
比較了各方法的Mapping 統(tǒng)計(jì)，miRXplore和血漿樣品的結(jié)果有很大的不同。SMARTer的Mapping 率是明顯較低的， EdgeSeq的Mapping 率最高，達(dá)到95%。在所有的方法中占比最大的miRNA-mapping reads都是很少的高豐度的miRNA。
圖2B: 血漿樣品中10個(gè)表達(dá)最高的miRNA。左邊ｙ軸表示血漿樣品中raw reads 的比例，右邊的y軸表示miRXplore 樣品中技術(shù)偏差的差異水平。虛線表示預(yù)期值的兩倍差異。
圖2B列出了每個(gè)方法中檢測到的表達(dá)量最高的10個(gè)miRNA，除了SMARTer 和NEXTflex，其余的方法中都有一個(gè)占比超過50%mapped reads的miRNA。雖然一些miRNA在所有的方法中檢出都是最高的，如血紅細(xì)胞特異的miR-451 和miR-16，與真實(shí)的量是一致的，但是其他的一些miRNA，如miR-10b 在 Norgen 和 Lexogen中由于結(jié)果偏倚導(dǎo)致了較高的差異（結(jié)果高出預(yù)期64倍以上）。
2.6? 累積頻率曲線分析
圖2C: miRXplore 和血漿樣品在線性和指數(shù)的累計(jì)頻率。虛線分別表示50%和1%的累積頻率。
為了評(píng)估在所有miRNA范圍內(nèi)的測序reads分布，進(jìn)行了累積頻率曲線分析（圖2C）。數(shù)據(jù)表明EdgeSeq 和 SMARTer 結(jié)果最好，而 Norgen 和 Lexogen 的表現(xiàn)最差。
2.7? 測序深度和檢出率分析
對(duì)不同測序深度和檢測閾值的miRNA檢出率進(jìn)行分析（圖2D）。大多數(shù)的方法在5M reads時(shí)檢出接近飽和，而SMARTer 和RealSeq方法增加測序深度會(huì)獲得更多的檢出。EdgeSeq、QIAseq和NEXTflex方法檢測到了最多數(shù)量的miRNA， Lexogen 和Norgen檢測到的miRNA最少。EdgeSeq檢測到的miRNA數(shù)量遠(yuǎn)超其他的方法。這不僅因?yàn)镋dgeSeq有更高的mapping rate，而且也歸因于較低特異性的雜交探針。
圖2E: 小提琴圖顯示了在miRXplore 樣品中的miRNA陽性和假陽性的水平
圖2E顯示了在miRXplore 樣品中存在的miRNA（陽性）和不存在的miRNA（假陽性）的數(shù)據(jù)。在所有的方法中EdgeSeq方法顯示有較高的假陽性率和較高的假信號(hào)強(qiáng)度，這也表明EdgeSeq方法在血漿樣品中有較高的檢出率部分原因可能是因?yàn)榧訇栃浴?/p>
圖2F: 各方法綜合評(píng)估
結(jié)論
總結(jié)各個(gè)方法的結(jié)果，沒有任何方法是最好的。與其他的研究結(jié)論一致，作者的結(jié)果也表明無需接頭連接的方法有最低的結(jié)果偏倚。EdgeSeq相較其他方法準(zhǔn)確性更加顯著，同時(shí)有更高的mapping 和檢出率。EdgeSeq的另外的優(yōu)點(diǎn)是其平臺(tái)的自動(dòng)化有更少的操作時(shí)間。EdgeSeq的缺點(diǎn)是有較高的分析成本和較低的特異性。
SMARTer是第二準(zhǔn)確和最省力的方法，然而這種方法有最低的mapping率和最高的假reads和假isomiRs。
RealSeq的準(zhǔn)確性與NEXTflex 和QIAseq類似。作者也發(fā)現(xiàn)環(huán)化的方法并不能消除結(jié)果偏倚?？紤]到RealSeq是使用的兩端接頭連接步驟，結(jié)果也說明了連接是結(jié)果偏倚的顯著來源。
在Lexogen、 Norgen 和 QIAseq 等3種傳統(tǒng)的基于連接的方法中，Lexogen 和Norgen的結(jié)果并不是很好，與前人的結(jié)果一致。較強(qiáng)的連接偏倚導(dǎo)致miRNA的不平衡，較低的覆蓋度和較低的檢出率，因此需要更深的測序深度。QIAseq同樣基于雙端連接，但結(jié)果在大多指標(biāo)中表現(xiàn)較好，作者認(rèn)為這并不是因?yàn)镼IAseq使用了UMI，而是因?yàn)樵摲椒ǖ募?xì)節(jié)是經(jīng)過合理優(yōu)化的。
除了方法間的比較，作者的數(shù)據(jù)也給出了改進(jìn)在生物流體中進(jìn)行small RNA 分析的幾個(gè)內(nèi)容：
首先，在血漿樣品中miRNA分布有較高的不平衡性，較少的miRNA耗費(fèi)了大多的reads，文庫構(gòu)建方法對(duì)miR-451 和 miR-16等含量較高的miRNA的檢測是有利的。其次，合成的樣品有已知背景的偏差，可以用于校準(zhǔn)在真實(shí)生物流體樣品中的準(zhǔn)確性及不同方法間的相關(guān)性。最后，跟最近其他的研究結(jié)果相反，作者的結(jié)果表明如果UMI設(shè)計(jì)不合理，可能會(huì)導(dǎo)致miRNA數(shù)量產(chǎn)生嚴(yán)重的錯(cuò)誤。
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