大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因其代謝途徑和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究透徹、培養(yǎng)周期短、目標(biāo)基因表達(dá)水平高且遺傳背景清楚，是目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。美中不足的是用其表達(dá)蛋白時經(jīng)常出現(xiàn)包涵體使蛋白不具生物活性。因此如何實現(xiàn)蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)就顯得至關(guān)重要。

AtaGenix（大腸桿菌可溶性蛋白表達(dá)成功率達(dá)到95%）認(rèn)為可以從五個方面進(jìn)行考慮：

1 去除信號肽

信號肽是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈（5-30 AAs），主要作用是促進(jìn)蛋白折疊成特定空間結(jié)構(gòu)，同時決定蛋白最終被定位到特定的亞細(xì)胞區(qū)。對于大多數(shù)大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)來說，信號肽基本喪失了它的功能，同時信號肽的疏水性會造成蛋白在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)成不可溶狀態(tài)，所以在大腸桿菌中表達(dá)蛋白通常要去掉信號肽，以促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)。

2 ?優(yōu)化密碼子

帶有相應(yīng)密碼子的tRNA將氨基酸引導(dǎo)到mRNA上進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯合成。在原核生物中，由不同tRNA含量的差異從而產(chǎn)生了對密碼子的偏愛性。大腸桿菌含有以下8種稀有密碼子：AGA/ AGG /CGG /CGA/AUA/CUA/GGA/CCC。如果基因是野生型的，最好先對其進(jìn)行稀有密碼子分析，如果密碼子稀有程度不高，可以使用Rosetta菌株用于表達(dá)這些含稀有密碼子基因的目的蛋白；如果密碼子稀有程度過高，最佳處理方式是經(jīng)過密碼子優(yōu)化后直接進(jìn)行基因合成。密碼子優(yōu)化是根據(jù)大腸桿菌對密碼子的偏好性進(jìn)行優(yōu)化篩選，一般選擇使用頻率大于20%的密碼子。經(jīng)過優(yōu)化的基因序列能提高mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，避免因為不充足的tRNA庫導(dǎo)致翻譯延遲、成熟前翻譯終止、翻譯移碼和氨基酸錯配。

3 選擇合適的表達(dá)載體

有了優(yōu)化的基因，要得到可溶性表達(dá)的蛋白，還得插入合適的表達(dá)載體。AtaGenix具有的pET28系列有廣泛的適用性，而pET22b可以將目的蛋白分泌到周質(zhì)空間以利于二硫鍵的形成和蛋白質(zhì)正確折疊，從而促進(jìn)目的蛋白的可溶性。pGEX4T、pET32和pET43.1 等融合系統(tǒng)可以通過融合蛋白起到促溶作用，增加目的蛋白的可溶性。另外pCold及pBAD系列載體也是不錯的選擇。

4 選擇恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)菌株

構(gòu)建了合適的表達(dá)載體，還得轉(zhuǎn)入恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)菌株進(jìn)行蛋白表達(dá)。進(jìn)行常規(guī)蛋白表達(dá)一般用菌株BL21；T7E可以增強(qiáng)蛋白的表達(dá)； Origami則可以促進(jìn)菌株胞質(zhì)中二硫鍵的形成； Arctic可在12℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)改善蛋白的可溶性及活性。

5 優(yōu)化表達(dá)條件

要想得到可溶性蛋白，除了對以上四個環(huán)節(jié)進(jìn)行控制以外，還需要進(jìn)行綜合考慮。通過對表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，比如表達(dá)載體與表達(dá)菌株相容性測試和誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化(包括培養(yǎng)基的選擇、誘導(dǎo)溫度的調(diào)整和誘導(dǎo)劑濃度的調(diào)整）等可以很大程度上解決形成蛋白包涵體的問題。

雖然我們一直在討論如何增強(qiáng)蛋白的可溶性，但也不要“談包涵體色變”：往往包涵體表達(dá)量都非常高，而且純化起來方便，更容易獲得高純度的蛋白樣品。對于一些需要蛋白免疫動物制備WB類用途的抗體實驗來說，包涵體也是一個非常不錯的選擇。

如果您恰好需要采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，希望這篇文章能給您提供幫助。當(dāng)然，選擇其他表達(dá)系統(tǒng)（枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)）可能會更高效的獲得活性蛋白。今后我們會逐一介紹這些表達(dá)系統(tǒng)的使用技巧。

如果您暫時不需要這方面的信息，也可以動動手指分享給朋友，興許他們正在為實驗而愁眉不展呢。

The End