前言

2021年11月，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院馮麗萍教授課題組在Science of the Total Environment期刊發(fā)表了題為“Transcriptomics integrated with metabolomics reveals the effect of ?Bisphenol F (BPF) exposure on intestinal inflflammation ”的研究成果，通過GC-MS非靶向代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法，發(fā)現(xiàn)了BPF暴露的腸道毒性的特征，探究了可能的發(fā)病機(jī)理。

中文標(biāo)題：轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合代謝組學(xué)揭示了雙酚F(BPF)暴露對(duì)腸道炎癥的影響

研究對(duì)象：人結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞系(NCM460)

發(fā)表期刊：Science of the Total Environment

影響因子：7.963

發(fā)表時(shí)間：2021年11月

合作單位：上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院

運(yùn)用生物技術(shù)：GC-MS非靶向代謝組學(xué)（由鹿明生物提供技術(shù)支持）、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、qRT-PCR

研究背景

BPA是一種內(nèi)分泌干擾物，對(duì)人體健康有害。有研究表明，長期暴露在BPA中，會(huì)誘發(fā)高血壓、糖尿病、胰島素抵抗、肥胖和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等疾病。因此，制造商現(xiàn)在使用雙酚類似物，例如雙酚F(BPF)、雙酚S(BPS)和雙酚AF(BPAF)來替代。BPF被廣泛應(yīng)用于我們?nèi)粘５陌b產(chǎn)品中，有研究發(fā)現(xiàn)一些亞洲的水樣本中BPF的濃度高達(dá)2850 ng/L。除此之外，BPF可以從食品包裝或水瓶中滲出，從而通過飲食進(jìn)入人腸道系統(tǒng)中。多項(xiàng)研究表明，BPF可能與BPA具有類似的潛在健康危害，例如導(dǎo)致斑馬魚雌激素受體基因和甲狀腺激素水平顯著增加；對(duì)人類生殖造成影響，可能導(dǎo)致女性的特發(fā)性不孕癥；圍產(chǎn)期暴露造成雄性小鼠后代肝臟代謝紊亂。

除此之外，還造成一些腸道的疾病。該研究為了評(píng)估BPF暴露對(duì)腸炎癥的潛在不良影響，檢測了促炎細(xì)胞因子的水平變化，以及腸上皮細(xì)胞NCM460中腸上皮緊密連接(TJ)蛋白、occluds -1 (ZO-1)和CLDN1(CLDN1)的變化。還使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)相結(jié)合的方法來探究BPF腸道毒性的潛在機(jī)制。

研究思路

研究結(jié)果

BPF暴露引起lps刺激細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)在NCM460細(xì)胞中

暴露在濃度為 10?7、 10?6和 10?5 M的BPF中48小時(shí)后，并未引起細(xì)胞活性的變化。濃度為 10?6 M的BPF暴露的細(xì)胞與DMSO（二甲亞砜）處理的細(xì)胞相比再經(jīng)過脂多糖處理后，IL-17A (圖 1b)、 TNF-α (圖 1e) 和IFN-γ (圖 1f）的基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。此外，這三個(gè)基因在10?6 M的BPF處理中，表達(dá)量明顯高于10?7M和10?5M。與對(duì)照組相比，單獨(dú)使用BPF和LPS處理均未顯著增加這些促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)（圖1）。因此，研究者選擇濃度為10?6 M的BPF進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 | BPF暴露導(dǎo)致NCM460細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子水平升高

BPF暴露和脂多糖導(dǎo)致NCM460細(xì)胞中緊密連接斷裂

作者使用RT-qPCR、免疫熒光顯微鏡和Western blot檢測了NCM460細(xì)胞中兩個(gè)細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和CLDN1的表達(dá)水平。RT-qPCR結(jié)果顯示在BPF暴露和LPS刺激組，這兩種蛋白明顯下調(diào)。此外，與DMSO處理的對(duì)照組細(xì)胞相比，BPF暴露的NCM460細(xì)胞的ZO-1和CLDN1的免疫熒光染色western blot信號(hào)通路強(qiáng)度減弱。

圖2 | BPF暴露導(dǎo)致NCM460細(xì)胞中腸緊密連接薄弱

BPF處理后NCM460細(xì)胞的差異表達(dá)基因(DEGs)和轉(zhuǎn)錄組分析

使用Fold change 2和pvalue＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，200個(gè)基因在BPF處理組和Con組之間有差異表達(dá)，其中94個(gè)上調(diào)，106個(gè)下調(diào)(圖3b)。GO富集分析顯示，差異基因在細(xì)胞發(fā)育負(fù)調(diào)控、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育負(fù)調(diào)控和受體活性調(diào)控生物過程中顯著富集。

在KEGG通路分析中(圖3d)， 70%的差異基因與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，40%的差異基因與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)，30%的差異基因與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)，20%的差異基因與免疫系統(tǒng)相關(guān)。根據(jù)GSEA分析，在BPF處理組中，Ras(圖3e)和磷脂酶D(圖3f)信號(hào)通路顯著富集。EGR1、RASGRP2、GRM3和PLA2G4E基因的表達(dá)使用RT-qPCR進(jìn)行了驗(yàn)證(圖4)。

圖3 | BPF處理后的NCM460細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析

圖4 | 使用RT-qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的差異基因

BPF治療改變腸上皮細(xì)胞NCM460的代謝譜

使用GC-MS非靶向代謝組學(xué)對(duì)BPF處理與DMSO處理細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的代謝物進(jìn)行檢測。總共檢測出 266個(gè)代謝物，其中45個(gè)在兩組間存在明顯差異（圖5d）。這些差異代謝物主要與縫隙連接、色氨酸代謝、cAMP信號(hào)通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用相關(guān)（圖5e，P＜0.05）。

圖5 | 代謝組學(xué)分析用于定量BPF處理組和對(duì)照組(DMSO處理組)的代謝物

對(duì)照組和BPF處理組中不同代謝物的層次聚類分析

聚類和多變量分析表明，差異代謝物呈現(xiàn)4個(gè)大的聚類：苯類化合物、脂類和類脂分子、有機(jī)酸及其衍生物及有機(jī)氧化合物和有機(jī)雜環(huán)化合物(圖6a)。布托啡諾、精胺、焦糖磷酸鹽、焦糖沒食子酚、n -乙酰-5-羥色胺、異蘇氨酸、琥珀酸乙酯、吡哆醇、n -乙酰腐胺和5-羥色胺能夠?qū)PF處理組和對(duì)照組區(qū)分開(圖6b和c)?？偟膩碚f，BPF處理組有著獨(dú)特的代謝組特征，值得深入研究這些代謝物與腸道發(fā)育以及與BPF暴露相關(guān)疾病的關(guān)系。

圖6 | 差異轉(zhuǎn)錄本、代謝物和促炎細(xì)胞因子的相關(guān)性分析

差異轉(zhuǎn)錄本、代謝物和促炎細(xì)胞因子的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明，在Ras信號(hào)通路、磷脂酶D信號(hào)通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用中顯著富集的差異基因與BPF處理組中豐度較高的代謝物高度相關(guān)。此外，SLC6A19與布托啡諾、精胺、異蘇氨酸、n -乙酰腐胺、2-甲基丙烯酸乙酯和5-羥色胺呈負(fù)相關(guān)(圖6d)。作者發(fā)現(xiàn)，在BPF處理組中，這些與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的代謝物在色氨酸代謝和cAMP信號(hào)通路中顯著富集。相關(guān)性分析還表明，BPF處理組的布托啡諾、精胺、n -乙酰-5-羥色胺等物質(zhì)與IL-17A水平呈正相關(guān)(圖6e)?？偟膩碚f，綜合分析揭露了NCM460細(xì)胞在BPF暴露后差異基因、鑒別代謝物和促炎細(xì)胞因子之間的關(guān)系。

研究討論

總的來說，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了BPF暴露的腸道毒性，以及證明了這種暴露可能會(huì)導(dǎo)致腸道炎癥，并改變腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和代謝組譜。聯(lián)合分析表明了炎癥反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄組和代謝組變化之間的組織協(xié)調(diào)。

文章提供的數(shù)據(jù)解釋了BPF暴露在腸道炎癥發(fā)病機(jī)制中的可能作用，以及和腸道炎癥相關(guān)疾病之間的關(guān)系。除此之外，該文章證明了采用多組學(xué)分析和體外模型來識(shí)別BPF類似物的毒性和干擾途徑的可行性，而且這種分析和模型可以減少傳統(tǒng)體內(nèi)測試所需的工作量。

小鹿推薦

通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)（GC-MS非靶向代謝組學(xué)）對(duì)BPF暴露和對(duì)照組的細(xì)胞進(jìn)行分析，篩選到差異的基因和代謝物。分別通過富集分析，找到差異基因或代謝物參與的條目或通路。最后通過差異轉(zhuǎn)錄本、代謝物和促炎細(xì)胞因子的綜合分析，揭露了它們之間的關(guān)系。本文通過多組學(xué)分析和體外模型的方式，發(fā)現(xiàn)了BPF暴露后腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和代謝組譜的改變，揭露了BPF可能在腸道炎癥發(fā)病機(jī)制的作用。

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文末看點(diǎn)｜lumingbio

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