比起盲目的開始WB實(shí)驗(yàn)操作，先了解清楚WB實(shí)驗(yàn)到底是為了什么確實(shí)是個(gè)不錯(cuò)的選擇。我們既要知其然，也要知其所以然！正好題主問出了這樣一個(gè)問題，那這篇文章我們就一起討論一下WB的本質(zhì)：

WB是什么？
WB實(shí)驗(yàn)是如何進(jìn)行的？
WB向我們展示了什么？
WB與相關(guān)分析技術(shù)有何不同？

在蛋白質(zhì)研究中，我們需要確定樣品中目標(biāo)蛋白是否存在和蛋白大小。無論是檢測或調(diào)查疾病，或者是確定基因操作實(shí)驗(yàn)的成功或失敗，還是確定食品樣品中潛在過敏蛋白的存在。為了確定目標(biāo)蛋白質(zhì)，我們通常需要將它與許多其他蛋白區(qū)分開來，其中一些可能具有相似的特性或大小。而蛋白質(zhì)印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)就是一種可以提供這些分析能力的技術(shù)。

掃描下方二維碼，回復(fù)關(guān)鍵詞實(shí)驗(yàn)831，即可領(lǐng)取《WB實(shí)驗(yàn)技術(shù)大全》

什么是蛋白質(zhì)印跡（Western blot）？

蛋白質(zhì)印跡，有時(shí)也稱為蛋白質(zhì)免疫印跡，是一種基于抗體的技術(shù)，用于檢測樣品中特定蛋白質(zhì)是否存在、大小和濃度。該技術(shù)由Harry Towbin及其同事于1979年開發(fā)，由于該技術(shù)與Southern印跡（DNA印跡）相似，因此后來將其命名為“蛋白質(zhì)印跡”。

簡而言之，溶液中的蛋白質(zhì)通過電泳分離。轉(zhuǎn)移到合適的膜后，使用目標(biāo)特異性抗體探測樣品?？梢詸z測這些抗體，并與已知標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ障啾龋u估結(jié)合蛋白的大小和濃度。

該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個(gè)方面。

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)方案（步驟）

下圖顯示了蛋白質(zhì)印跡的實(shí)驗(yàn)方法

蛋白質(zhì)印跡凝膠

在進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡之前，必須分離樣品中的蛋白質(zhì)。這通常是通過蛋白質(zhì)電泳實(shí)現(xiàn)的，例如十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或天然PAGE，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量或電荷分離蛋白質(zhì)。選擇的具體分離方法取決于分析的目的。為了獲得清楚的圖像，樣品被離心以去除固體，以便在電泳中僅使用可溶部分的蛋白。如果您的目標(biāo)蛋白在不溶部分（例如，細(xì)胞膜結(jié)合蛋白質(zhì)）中，可以先研究預(yù)處理方法以首先將其釋放和溶解。固體蛋白會影響凝膠的運(yùn)行，目標(biāo)蛋白很可能會留在濃縮膠中。

上樣適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)樣本和大小標(biāo)記也很重要，以解釋最終印跡的結(jié)果。

蛋白質(zhì)印跡的上樣控制

了解上樣多少樣品非常重要，尤其是在嘗試比較不同樣品之間的蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，因?yàn)閮H通過印跡可能無法看出這一點(diǎn)。例如，在評估蛋白印跡時(shí)，一個(gè)樣品的條帶可能比另一個(gè)樣品的亮度高兩倍。這可能意味著該樣品中目標(biāo)蛋白的數(shù)量是其他樣品的兩倍，或者可能意味著一個(gè)泳道上樣的樣品數(shù)量或濃度更高。運(yùn)行重復(fù)的蛋白質(zhì)凝膠并用考馬斯染色顯影有助于消除這種不確定性，因?yàn)樗鼤@示總蛋白量在每個(gè)樣品通道中，可以揭示上樣的不一致。檢測所有樣品中普遍存在的蛋白質(zhì)的表達(dá)，例如全細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)樣品中的肌動蛋白，也可以用作上樣對照，有助于確保蛋白質(zhì)樣品向膜的轉(zhuǎn)移一致。但是，在比較“對照”蛋白質(zhì)表達(dá)不同的模型（例如變性模型）時(shí)，這種類型的對照可能會出現(xiàn)問題。

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移（印跡）

蛋白質(zhì)必須從蛋白質(zhì)凝膠轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)哪ぃㄍǔＪ窍跛崂w維素或聚偏二氟乙烯(PVDF)）以促進(jìn)抗體探測。許多技術(shù)可用于轉(zhuǎn)移，包括毛細(xì)管轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散轉(zhuǎn)移和真空印跡，但由于其速度和效率，迄今為止最常見的是電印跡（也稱為電洗脫或電泳轉(zhuǎn)移）。在這里，蛋白質(zhì)凝膠夾在轉(zhuǎn)移膜上并施加電流。來自凝膠的蛋白質(zhì)被攜帶穿過并緊緊附著在膜上。

在電印跡中，還有多種轉(zhuǎn)移策略，稱為濕轉(zhuǎn)移、半干轉(zhuǎn)移和干轉(zhuǎn)移。濕轉(zhuǎn)移效率高，提供靈活的緩沖，但很耗時(shí)。半干轉(zhuǎn)移速度更快，具有靈活性，但對于大蛋白質(zhì)而言，效率低于濕轉(zhuǎn)移。干式轉(zhuǎn)印既高效又快速，但與其他方法相比靈活性較差。

可以在使用可移除的染色劑（例如PonceauS.）進(jìn)行探測之前評估轉(zhuǎn)移效率。

蛋白質(zhì)印跡阻斷

由于印跡膜對蛋白質(zhì)具有高親和力，因此在轉(zhuǎn)移后阻斷任何剩余的結(jié)合位點(diǎn)以防止隨后的測定檢測抗體的非特異性結(jié)合非常重要。這一步驟是通過將膜與蛋白質(zhì)液體（如牛奶或血清）一起孵育來實(shí)現(xiàn)的。

蛋白質(zhì)印跡洗滌

封閉后，重要的是在每個(gè)步驟之間清洗膜以去除多余的或未結(jié)合的試劑。洗滌不充分或不均勻會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)質(zhì)量差、斑塊印跡和高背景。然而，過度洗滌會減少目標(biāo)信號，因此優(yōu)化洗滌步驟的數(shù)量和持續(xù)時(shí)間很重要。確保膜被適當(dāng)?shù)木彌_液充分覆蓋并輕輕攪拌以均勻洗滌膜而不會損壞它。常用的緩沖液包括Tris緩沖液(TBS)和磷酸鹽緩沖液(PBS)，通常包含吐溫20（TBST和PBST）。

蛋白質(zhì)印跡抗體

雖然可以對蛋白質(zhì)印跡使用直接檢測（識別目標(biāo)并且可檢測的單一抗體），但更多情況下使用間接方法（如下圖）。在這里，一抗用于探測膜并結(jié)合存在的任何目標(biāo)蛋白。然后，使用與一抗結(jié)合且可檢測的二抗。與所有步驟一樣，這一步驟也需要優(yōu)化，在這種情況下選擇“正確”的抗體并確定最佳濃度，是良好印跡的關(guān)鍵。

蛋白質(zhì)印跡二抗

當(dāng)使用間接檢測法時(shí)，需要將多余的未結(jié)合的一抗從膜上洗掉后使用二抗。二抗應(yīng)該對一抗的種類具有特異性（例如，如果一抗來自兔，則為小鼠抗兔），并具有所選檢測方法所需的偶聯(lián)物。

蛋白質(zhì)印跡分析

有多種檢測和后續(xù)蛋白質(zhì)印跡可視化的方法，包括比色、化學(xué)發(fā)光、熒光和放射性檢測，總結(jié)在下圖中。

比色和化學(xué)發(fā)光檢測需要酶檢測的抗體綴合，并且被認(rèn)為是非常敏感的技術(shù)。辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)是最常用的酶，HRP由于其穩(wěn)定性、對大多數(shù)結(jié)合的適應(yīng)性和低成本而受到普遍青睞。在檢測過程中，將底物添加到膜上，結(jié)合酶作用于該底物，引起化學(xué)變化。如果進(jìn)行比色檢測，則選擇顯色底物，該底物將產(chǎn)生可直接可視化和成像的變化。然而，及時(shí)對印跡成像很重要，因?yàn)橛≯E干燥后顏色會褪色。在化學(xué)發(fā)光檢測中，產(chǎn)生的信號僅在酶和底物之間發(fā)生反應(yīng)時(shí)持續(xù)（通常為1-24小時(shí)）。在此期間，可以通過曝光X射線膠片或使用數(shù)字成像進(jìn)行永久記錄來記錄信號。

在熒光檢測中，檢測抗體與熒光團(tuán)而不是酶結(jié)合。當(dāng)特定波長的光照射在它們上時(shí)，它們會被激發(fā)并發(fā)出不同特定波長的光。然后可以使用數(shù)字成像器（例如光電二極管(APD)、光電倍增管(PMT)或電荷耦合器件(CCD)相機(jī)）直觀地捕捉到這一點(diǎn)。雖然需要專業(yè)設(shè)備來進(jìn)行激發(fā)和檢測步驟，但熒光檢測中沒有底物步驟，從而縮短了實(shí)驗(yàn)步驟。也可以在蛋白質(zhì)印跡分析中使用多重?zé)晒鈭F(tuán)。

過去廣泛使用放射性檢測，其中放射性同位素與檢測抗體結(jié)合，并在X射線膠片上檢測發(fā)射的輻射。然而，該技術(shù)需要特殊處理以保護(hù)人員免受輻射，而且價(jià)格昂貴并且由于放射性衰變而具有有限的保質(zhì)期。因此，該技術(shù)大多已被其他可用的檢測方法所取代。

蛋白質(zhì)印跡剝離

剝離是從蛋白質(zhì)印跡膜上去除一抗和二抗的過程。如果您希望在特定印跡上研究多個(gè)目標(biāo)蛋白而不是運(yùn)行多個(gè)印跡，例如在樣品非常有價(jià)值或稀缺的情況下，這會很有幫助。

請注意，剝離也可能會從膜上去除一些蛋白質(zhì)，因此無法在剝離前后進(jìn)行定量比較，并且不應(yīng)在剝離的膜上進(jìn)行蛋白質(zhì)缺失的檢查。

如果您打算剝離印跡，建議使用PVDF膜，因?yàn)樗鼈冊趧冸x后比硝化纖維素更能保留蛋白質(zhì)。比色檢測還會留下永久性污漬，因此化學(xué)發(fā)光檢測適用于該應(yīng)用。

如果可能，從低pH值的溫和剝離緩沖液開始，以最大限度地減少樣品損失，如果不成功，則嘗試通過清潔劑或加熱進(jìn)行更嚴(yán)格的剝離步驟。

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果和定量

使用X射線膠片從蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中獲得結(jié)果時(shí)，通常需要曝光多張膠片以優(yōu)化曝光和顯影時(shí)間。時(shí)間不夠長，樣本帶可能很暗或根本不可見。時(shí)間太長，背景信號變得太強(qiáng)，條帶合并在一起，所得印跡非常暗且難以分析。與目標(biāo)濃度不平衡的對照或大小標(biāo)記也可能存在問題，其中一個(gè)在另一個(gè)足夠可見之前曝光過度。然后可以將膠片數(shù)字化以使用分析軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析。

使用X射線膠片的檢測方法被認(rèn)為是定性或半定量的。將樣品泳道中的條帶與對照和大小標(biāo)記進(jìn)行比較有助于確定樣品中目標(biāo)的存在與否。然而，如果需要定量，例如使用基于CCD相機(jī)的設(shè)備進(jìn)行數(shù)字成像，由于其更大的動態(tài)范圍、更高的靈敏度和更高的分辨率，提供了更好的選擇。無需重復(fù)耗時(shí)的X射線膠片曝光和顯影，即可微調(diào)曝光時(shí)間，從而優(yōu)化信噪比。然后可以輕松地將其輸入到可以分析并比較數(shù)據(jù)的軟件中。

蛋白質(zhì)印跡故障排除

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)方案中存在許多出錯(cuò)的機(jī)會，在此我們重點(diǎn)介紹一些常見問題并提供潛在的解決方案。

凝膠上蛋白質(zhì)條帶的分離不充分/定位不佳——優(yōu)化蛋白質(zhì)凝膠百分比和運(yùn)行時(shí)間以適合您的目標(biāo)蛋白。
印跡上沒有任何東西，甚至兩marker都沒有——確保印跡套件按正確的順序放在一起，并且電流以正確的方向運(yùn)行，否則您的樣品會印跡到緩沖液中。
印跡看起來凌亂、斑駁——確保在設(shè)置轉(zhuǎn)移時(shí)凝膠和膜之間沒有氣泡。確保膜完全浸沒并在孵育和洗滌步驟中輕輕混合，以產(chǎn)生均勻的結(jié)果?；蛘呤褂眯迈r的封閉試劑。
高背景——封閉或洗滌可能不夠。
對照樣品的結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不一致——優(yōu)化抗體選擇/濃度以最大限度地減少非特異性/脫靶結(jié)合。檢查您的實(shí)驗(yàn)假設(shè)和概念。
在最終印跡上很難看到條帶（太暗或太亮）——優(yōu)化檢測階段的顯影時(shí)間以增加或減少信號強(qiáng)度。如果條帶太亮，也可能表明洗滌過度。優(yōu)化抗體濃度并考慮您選擇的抗體也可能有所幫助。

Southern印跡與蛋白質(zhì)印跡

蛋白質(zhì)印跡旨在檢測特定蛋白質(zhì)，而Southern印跡于1975年開發(fā)并以其發(fā)明者Edwin Southern的名字命名，用于檢測特定DNA序列。與蛋白質(zhì)印跡一樣，樣品通過電泳分離并轉(zhuǎn)移到膜上。然而，在檢測之前，使用與您希望檢測的區(qū)域互補(bǔ)的序列的DNA片段來探測膜。

Northern印跡與蛋白質(zhì)印跡

Northern印跡，由James Alwine、David Kemp和George Stark于1977年開發(fā)，用于檢測特定的mRNA序列。與蛋白質(zhì)印跡和Southern印跡一樣，進(jìn)行Northern印跡的樣品通過電泳分離并轉(zhuǎn)移到膜上。然后將具有與感興趣區(qū)域互補(bǔ)的序列的cDNA片段用作檢測前的探針。

蛋白質(zhì)印跡與SDS-PAGE

SDS-PAGE是一種用于根據(jù)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)，而蛋白質(zhì)印跡是檢測特定蛋白質(zhì)存在所需的整個(gè)過程。SDS-PAGE通常是蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)方案中選擇的電泳技術(shù)，作為在印跡前分離樣品中所有蛋白質(zhì)的一種手段。

蛋白質(zhì)印跡目的

檢測樣品中目標(biāo)蛋白的存在、大小和濃度的原因有很多，這些原因可以跨越多個(gè)科學(xué)學(xué)科。除了目標(biāo)的存在與否，該技術(shù)還可以評估：

蛋白質(zhì)-DNA相互作用——DNA結(jié)合蛋白與特定DNA序列的連接對于轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程至關(guān)重要。Southwestern印跡（類似于蛋白質(zhì)印跡，除了用DNA探測膜外）可用于識別基因調(diào)控研究中的轉(zhuǎn)錄因子。
蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用——這些對許多基本的細(xì)胞過程至關(guān)重要。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的檢測，使用已知的蛋白質(zhì)印跡的變化遠(yuǎn)印跡，可有助于闡明細(xì)胞功能和功能障礙。
翻譯后修飾(PTM)——PTM影響蛋白質(zhì)折疊并因此影響功能，擴(kuò)大蛋白質(zhì)組多樣性。然而，異常的PTM與多種因素有關(guān)。因此，他們的研究引起了研究人員的極大興趣，蛋白質(zhì)印跡提供了一種這樣的工具來做到這一點(diǎn)。
蛋白質(zhì)異構(gòu)體檢測——蛋白質(zhì)可能在不同細(xì)胞狀態(tài)下以不同的異構(gòu)體表達(dá)，具有不同的活性或目標(biāo)。或者，它們可能需要裂解才能被激活。
抗體表征——當(dāng)抗體作為工具或療法生產(chǎn)時(shí)，它們的驗(yàn)證和表征對確保正確的性能和安全性至關(guān)重要。作為一種基于抗體的方法，蛋白質(zhì)印跡是該過程中的一項(xiàng)有用技術(shù)。
表位作圖——了解抗體如何以及在何處結(jié)合其靶蛋白對于研究、診斷和治療目的很有價(jià)值。有許多工具可用于實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，并且由于其特殊性，蛋白質(zhì)印跡就是其中之一。
亞細(xì)胞蛋白定位——對不同細(xì)胞組分進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析可以確定目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中的位置。單細(xì)胞蛋白質(zhì)印跡在該領(lǐng)域提供了很好的見解，并克服了其他單細(xì)胞檢測所遇到的一些抗體交叉反應(yīng)問題。

下面討論一些常見的應(yīng)用形式

確定蛋白質(zhì)是否表達(dá)

評估基因組數(shù)據(jù)可以告訴您所討論的生物體是否有可能產(chǎn)生某些蛋白質(zhì)。查看轉(zhuǎn)錄組會告訴您相關(guān)基因是否已開啟，但直到您能夠檢測到實(shí)際蛋白質(zhì)，您才能判斷它是否正在積極表達(dá)。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性基因組操作時(shí)，這非常有助于確定基因組水平的變化是否反映在蛋白質(zhì)水平的預(yù)期變化（例如，與野生蛋白質(zhì)相比，新蛋白質(zhì)的表達(dá)、截?cái)嗷虮磉_(dá)缺失）。菌株或者細(xì)胞是否在預(yù)期的組織或位置中表達(dá)？

檢測標(biāo)記蛋白

在進(jìn)行基因操作時(shí)，可以設(shè)計(jì)和添加標(biāo)簽，例如His標(biāo)簽和GST標(biāo)簽。這使得它們所附著的蛋白質(zhì)很容易在所研究的物種或系統(tǒng)的樣本中找到，從而提供有關(guān)相關(guān)蛋白質(zhì)的位置和特征的信息。例如，是在某些條件下從細(xì)胞膜上裂解下來的膜蛋白。這在檢查實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的重組蛋白時(shí)也很有用。

映射隨時(shí)間或組之間的變化

對時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡可以提供有關(guān)蛋白質(zhì)水平隨時(shí)間變化的信息，例如在不同的細(xì)胞周期階段。同樣，當(dāng)比較來自不同疾病或治療組的樣本時(shí)，它可以突出蛋白質(zhì)水平的變化，這可能表明疾病的根本原因或影響治療效果。

總的來說，與PCR之類的技術(shù)相比，蛋白質(zhì)印跡不被認(rèn)為是一種特別的定量技術(shù)。然而，它提供的蛋白質(zhì)的直接檢測意味著它在確診疾病診斷中具有很大的實(shí)用性。

非傳染性疾病的生物標(biāo)志物

不同的蛋白質(zhì)亞型可以作為病理過程的生物標(biāo)志物，例如在癌癥中。自身抗體，表明自身免疫性疾病，也可能被檢測到。雖然質(zhì)譜法常用于檢測，但仍使用蛋白質(zhì)印跡等基于抗體的技術(shù)來確認(rèn)高通量方法的發(fā)現(xiàn)。

傳染病診斷

Western印跡被用于疾病確認(rèn)情況下，如人免疫缺陷病毒（HIV），萊姆病，牛海綿狀腦?。˙SE）和曲霉病。然而，與PCR等技術(shù)相比，它非常耗時(shí)，并且在包括HIV檢測在內(nèi)的許多情況下已被替代分析所取代。