實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

1.?掌握綠色熒光蛋白基因gfp作為報(bào)告基因的原理

2.?掌握PCR方法擴(kuò)增基因的原理和方法

實(shí)驗(yàn)原理：

????聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction， 簡稱PCR）是于上世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，即在模板DNA、引物、脫氧核糖核酸存在的情況下，經(jīng)過耐熱DNA聚合酶的作用，通過模板DNA的變性，DNA與引物的退火及引物的延伸三個(gè)步驟，循環(huán)反復(fù)，使DNA片段在短時(shí)間內(nèi)迅速擴(kuò)增，幾小時(shí)內(nèi)將待擴(kuò)增基因放大幾百萬倍，使得肉眼就能直接觀察，便于DNA的分析檢測，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時(shí)等特點(diǎn)。

????本實(shí)驗(yàn)中使用的TransStart FastPfu DNA Polymerase是用于快速PCR擴(kuò)增的熱啟動(dòng)、高保真DNA聚合酶，其擴(kuò)增能力強(qiáng)、擴(kuò)增速度快，保真性為常規(guī)Taq DNA聚合酶的54倍，其PCR產(chǎn)物為平末端，不同于Taq DNA聚合酶。PCR產(chǎn)物可用于平末端連接

實(shí)驗(yàn)材料：

1.?試劑：載體pCAMBIA1302；TransStart FastPfu DNA Polymerase（全式金）；引物（gfpf：5-GGATCCAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC-3；gfpr：5-CTCGAGTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3，安徽通用（系統(tǒng)）生物公司合成）；dNTPS（10mM?each）；1×TAE電泳緩沖液；Loading buffer；瓊脂糖。

2.?實(shí)驗(yàn)器具：PCR儀，電泳儀，凝膠成像儀。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.?稀釋DNA模板pCAMBIA1302（10倍、50倍、100倍）

2.?按照下表配制PCR反應(yīng)Mixture，每個(gè)反應(yīng)體系25μl。

3.?PCR擴(kuò)增gfp基因，反應(yīng)程序見下表：

4.?電泳及凝膠成像儀檢測。