寫在前面

????????今天推薦的是由美國加州Genentech公司團隊在2017年8月18日發(fā)表于Nature（IF：42.475，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Ingrid E. Wertz博士，研究表明USP7小分子抑制劑干擾泛素的結(jié)合。

研究背景

????????泛素系統(tǒng)調(diào)控真核生物的基本細胞過程。泛素以單體或鏈的形式連接底物蛋白，泛素修飾的拓撲結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)底物與特定蛋白的相互作用。因此，泛素化指導了各種底物的命運，包括蛋白體降解。去泛素酶從底物上裂解泛素，并與疾病有關(guān)；例如，泛素特異性蛋白酶-7（USP7）調(diào)節(jié)p53腫瘤抑制因子和其他對腫瘤細胞生存至關(guān)重要的蛋白的穩(wěn)定性。然而，開發(fā)選擇性的去泛素酶抑制劑一直是個挑戰(zhàn)，而且還沒有解決小分子抑制劑的共晶體結(jié)構(gòu)。

摘要部分

????????在這里，利用基于核磁共振的篩選和基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計，作者描述了選擇性USP7抑制劑GNE-6640和GNE-6776的開發(fā)。這些化合物能誘導腫瘤細胞死亡，增強化療藥物和靶向化合物的細胞毒性，包括PIM激酶抑制劑。結(jié)構(gòu)報告顯示，GNE-6640和GNE-6776以非共價方式靶向USP7，距離催化半胱氨酸有12??。這些化合物削弱了泛素的結(jié)合，從而抑制了USP7脫泛素酶的活性。GNE-6640和GNE-6776與介導與泛素Lys48側(cè)鏈的氫鍵相互作用的酸性殘基相互作用，這表明USP7優(yōu)先與具有自由Lys48側(cè)鏈的泛素分子相互作用并進行切割。作者通過設(shè)計含有不同的近端和遠端同位素標簽的雙泛素鏈并通過核磁共振測量USP7的結(jié)合來研究這一觀點。這種優(yōu)先結(jié)合延長了Lys48連接的泛素鏈相對于Lys63連接的鏈的解聚動力學?？傊?，通過減弱泛素結(jié)合來抑制USP7活性的工程化合物為開發(fā)其他去泛素酶抑制劑提供了機會，并且可能是一種更廣泛適用于抑制需要泛素結(jié)合才能發(fā)揮全部功能的蛋白質(zhì)的策略。

研究內(nèi)容

1.USP7抑制劑的鑒定和特征分析??? ? ?

????????USP7是一種經(jīng)基因驗證的MDM2的去泛素酶，MDM2是一種促進腫瘤抑制因子p53降解的泛素連接酶。剝奪USP7會增強USP7底物的泛素化，包括MDM2。隨后的MDM2蛋白體降解可穩(wěn)定p53，從而促進細胞周期停滯和凋亡。? ? ?

????????為了確定USP7抑制劑，作者建立了一個基于活性的高通量篩選級聯(lián)。同時，作者開發(fā)了一個核磁共振（NMR）篩查，以確定USP7催化域的結(jié)合片段。選擇性試驗和結(jié)構(gòu)生物學在級聯(lián)的頂端指導藥物化學設(shè)計。測量總的和泛素化的MDM2水平的試驗被用作USP7活性的近端指標，然后用匹配的化學系列的非活性化合物作為陰性對照進行生存能力試驗。

????????通過對母體片段GNE-2916的優(yōu)化產(chǎn)生了GNE-6640和GNE-6776。這些USP7抑制劑增強了內(nèi)源性MDM2泛素化，同時實現(xiàn)了對USP47和USP5的選擇性。因此，GNE-6640和GNE-6776，能促進內(nèi)源性MDM2與Lys48（K48）連接的多聚泛素鏈的泛素化，從而指導蛋白酶體降解?；钴S的USP7抑制劑穩(wěn)定了p53，并在野生型細胞中上調(diào)了p21，但在p53缺失或USP7缺失的細胞中卻沒有。因此，證明GNE-6640和GNE-6776針對細胞USP7、MDM2和p53信號通路。

研究結(jié)論：利用基于核磁共振的篩選和基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計，篩選到了USP7抑制劑GNE-6640和GNE-6776。

?

2.USP7抑制劑的選擇性以及與PIM激酶抑制的協(xié)同作用? ? ?

????????鑒于這些抑制劑的有利特點，作者研究了它們在動物模型中的療效。在確認了GNE-6640和GNE-6776的選擇性，細胞活性及其口服利用率之后，作者在3天的存活率試驗中預選了441個細胞系，研究發(fā)現(xiàn)GNE-6641在5天的存活率實驗中仍然沒有活性，而GNE-6640和GNE-6776分別降低了54個和6個細胞系的存活率，IC50≤10μM。? ? ?

????????盡管這兩種化合物在TP53野生型細胞系中都降低了增殖和激活了caspases，但在TP53缺失型細胞系中，這些效應(yīng)有所降低。將GNE-6640與多柔比星或順鉑結(jié)合使用，可增強USP7抑制劑的功效。因此，MDM2或p53途徑是GNE-6640和GNE-6776細胞活性的媒介，但不是唯一的決定因素。另一方面，作者發(fā)現(xiàn)GNE-6640與破壞DNA的藥物聯(lián)合使用的療效增強，這表明了一種確定與USP7抑制相交的信號通路的策略。? ? ?

????????在機理研究中，GNE-6776促進了AML細胞系中p21水平的升高，而PIM2水平則降低。抑制泛素激活酶UAE1或蛋白酶體抑制劑硼替佐米可以挽救GNE-6776引起的PIM2水平下降。在USP7缺失的細胞中，PIM2的水平較低，這被蛋白酶體的抑制所回補，共同表明USP7通過泛素和蛋白酶體依賴的機制穩(wěn)定PIM2的水平。

????????用GNE-6776、GDC-0570或這兩種化合物處理的時間過程顯示，GDC-0570減少了Bad和S6的磷酸化，降低了短壽命蛋白p21和Mcl-1的表達。GNE-6776減少了PIM2的水平。GNE-6776和GDC-0570的聯(lián)合處理增強了聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）和caspase-3的裂解，從機制上證實了細胞活力的研究。因此，作者推測PIM2是USP7的底物。為了支持這一觀點，內(nèi)源性USP7和PIM2共同免疫沉淀，GNE-6776處理增強了PIM2泛素化。重組的USP7，在體外使PIM2去泛素化。因此，同時抑制PIM激酶和USP7抑制劑介導的蛋白質(zhì)降解比單獨的任何一種處理都更能拮抗PIM的活性和細胞生存能力。這些數(shù)據(jù)揭示了USP7和PIM信號之間的串擾，擴大了USP7調(diào)節(jié)的致癌途徑的范圍。

研究結(jié)論：USP7通過泛素和蛋白酶體依賴的機制穩(wěn)定PIM2的水平，PIM2是USP7的底物。

?

3.USP7抑制劑與泛素結(jié)合的USP7競爭

????????鑒于GNE-6640和GNE-6776的選擇性和有效性，了解這些工具化合物抑制USP7的分子機制是有意義的。作者通過酶學研究驗證了通過削弱底物結(jié)合實現(xiàn)對USP7內(nèi)在活性的抑制。將GNE-6776和GNE-6640與USP7泛素復合物的共晶體結(jié)構(gòu)進行比較，發(fā)現(xiàn)這些化合物立體地抑制了泛素的結(jié)合，并阻止了USP7催化結(jié)構(gòu)域KG5螺旋向活性構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。鑒于USP7催化結(jié)構(gòu)域和泛素5之間的廣泛相互作用，作者調(diào)查了與泛素K48側(cè)鏈相互作用的USP7殘基的重要性。通過點突之后的相互作用分析，作者證明泛素-K48和USP7-D305/E308殘基對于USP7泛素結(jié)合和底物去泛素化至關(guān)重要。

研究結(jié)論：USP7抑制劑與泛素結(jié)合的USP7競爭，泛素-K48和USP7-D305/E308殘基對于USP7泛素結(jié)合和底物去泛素化至關(guān)重要。

?

4.USP7促進PHF8穩(wěn)定的生物學功能

????????GNE-6640和GNE-6776的結(jié)合模式表明，USP7可能優(yōu)先與具有自由K48側(cè)鏈的泛素分子結(jié)合。從機制上講，這可能將USP7引向K48連接的聚泛素的遠端亞單位，導致從遠端到近端鏈的順序解聚（外裂）。為了評估這個想法，作者設(shè)計了K48和K63連接的雙泛素，使用光譜學上不同的氨基酸對遠端和近端泛素亞基進行不同的標記。核磁共振分析顯示，USP7催化域優(yōu)先與K48連接的二泛素遠端亞單位結(jié)合，而USP7催化域與近端和遠端K63連接的二泛素亞單位的結(jié)合情況相似。D305A USP7和D305A/E308A USP7催化域突變體都表現(xiàn)出與近端和遠端K48連接的二泛素亞基的類似結(jié)合。

????????在這些數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，作者評估了不同的二泛素結(jié)合是否會影響USP7解聚泛素鏈的動態(tài)。USP7裂解K6、K11、K33、K48和K63連接的二泛素的kcat和Km值相似，表明不同的異肽鍵構(gòu)象不會對裂解效率產(chǎn)生實質(zhì)性影響。作者的研究顯示，USP7從遠端殘基開始依次解聚四-K48連接的泛素（外裂解），而四-K63泛素鏈則通過外裂解、內(nèi)裂解或基底裂解的組合進行裂解。

研究結(jié)論：USP7優(yōu)先結(jié)合具有自由K48側(cè)鏈的泛素分子，導致K48連接的聚

?

結(jié)論與討論

????????研究顯示，USP7脫泛素酶活性和PIM激酶在調(diào)節(jié)細胞活力方面有未報道過的交叉點。突變分析證實了GNE-6640或GNE-6776的共晶體結(jié)構(gòu)，指出了USP7-D305/E308和泛素-K48側(cè)鏈之間互補電荷作用的重要性。同時，作者通過核磁共振分析顯示，USP7優(yōu)先與具有自由K48側(cè)鏈的泛素分子相互作用。開發(fā)削弱泛素結(jié)合的選擇性抑制劑是抑制USP7的一個有效策略。作者的研究證明了這種方法的可行性，它可能在抑制其他類別的泛素結(jié)合蛋白方面有更廣泛的應(yīng)用。

?

Thank you!

?

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/nature24006