RAW264.7細(xì)胞是一種非常重要的細(xì)胞系，因?yàn)樗梢员挥糜谘装Y研究和細(xì)胞免疫學(xué)研究中。這篇文章將介紹怎樣使用DMEM和胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基來培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，以及如何進(jìn)行細(xì)胞傳代和保存。

1. 培養(yǎng)基制備

RAW264.7細(xì)胞最常用的培養(yǎng)基為DMEM，這是一種包含豐富營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基。添加FBS可以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，起到刺激細(xì)胞增殖和防止凋亡的作用。

在制備培養(yǎng)基之前，要先準(zhǔn)備好下列材料：

- DMEM培養(yǎng)基
- 胎牛血清（FBS）
- 靶標(biāo)抗生素和抗生素混合物（如青霉素/鏈霉素）

制備步驟如下：

1）將DMEM培養(yǎng)基放入滅菌瓶中，并加入10%的FBS（即10ml FBS加入90ml DMEM），混合均勻后添加抗生素或抗生素混合物。

2）將制備好的培養(yǎng)基過濾滅菌，使用無菌針過濾器過濾，以避免細(xì)菌污染。

2. 細(xì)胞和培養(yǎng)條件

在培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞時(shí)，必須提供適合它們生長(zhǎng)的環(huán)境以確保它們能夠存活和繁殖。下面是RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)條件：

- 培養(yǎng)溫度：37°C
- CO2濃度：5%
- 恒溫箱：生物安全柜或潔凈室內(nèi)

3. 培養(yǎng)細(xì)胞

在開始培養(yǎng)之前，請(qǐng)確保對(duì)實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行消毒，以避免外部污染的影響。

3.1 細(xì)胞的解凍

1）使用1%的DMEM溶液將冰凍細(xì)胞凍存管均勻地加溫到37°C；

2）將解凍細(xì)胞緩慢地加入到10ml的預(yù)先準(zhǔn)備的DMEM/FBS培養(yǎng)基中，并緩慢搖晃，以避免產(chǎn)生氣泡或過度攪拌。

3）在生物安全柜內(nèi)將培養(yǎng)瓶放置在37℃/5% CO2孵化箱中，大約30-40分鐘后細(xì)胞會(huì)開始連接在一起。

4）添加新的DMEM/FBS培養(yǎng)基以覆蓋所有細(xì)胞，并將細(xì)胞放回37℃/5% CO2的培養(yǎng)箱中。

5）在24小時(shí)后再次將培養(yǎng)瓶檢查一遍，檢查培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞有沒有繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂，如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞正在死亡則需盡快更換培養(yǎng)基。

3.2 細(xì)胞的維護(hù)

RAW264.7細(xì)胞需要保持在恒溫箱中生長(zhǎng)，因?yàn)樗鼈冃枰m宜的溫度和環(huán)境，以便維持正常的生命活動(dòng)。為此，我們要經(jīng)常更換培養(yǎng)基，以確保細(xì)胞能夠獲得所需的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子。

1）觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)：使用顯微鏡觀察細(xì)胞是否生長(zhǎng)繁殖，在維持恒定的溫度和氣體濃度，并更換培養(yǎng)基。

2）更換培養(yǎng)基：在培養(yǎng)箱內(nèi)使用無菌技術(shù)更換新的培養(yǎng)基，要耐心地進(jìn)行這項(xiàng)操作，并確保不產(chǎn)生氣泡或其他污染。

3）細(xì)胞分化：生長(zhǎng)至80%~90%π密度時(shí)，要將細(xì)胞進(jìn)行傳代，以保證活性和穩(wěn)定性。

3.3 細(xì)胞傳代

當(dāng)整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面覆蓋了大量的細(xì)胞時(shí)，就需要將細(xì)胞進(jìn)行傳代（或稱細(xì)胞分裂）。傳代可以延長(zhǎng)細(xì)胞的生命周期，并保持其形態(tài)及性質(zhì)，同時(shí)也可以進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)。

以下是RAW264.7細(xì)胞傳代的步驟：

1）收集盡可能多的細(xì)胞；

2）將胞體分散均勻：用1ml的10倍稀釋液預(yù)先將細(xì)胞進(jìn)行解聚，并將懸浮液使用移液器盡可能均勻涂抹在培養(yǎng)瓶中。

3）更換培養(yǎng)基：繼續(xù)添加新培養(yǎng)基，更換后觀察其生長(zhǎng)情況。如果生長(zhǎng)情況不佳，可以將培養(yǎng)瓶進(jìn)行滾動(dòng)、震蕩或輕輕搖動(dòng)，幫助細(xì)胞完全分散。

4）維持適宜的生長(zhǎng)條件：細(xì)胞分散后維持培養(yǎng)箱中的37℃和5%的CO2濃度，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。

5）更換培養(yǎng)基：每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子。

3.4 細(xì)胞保存

定期保存RAW264.7細(xì)胞可以幫助科學(xué)家實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期或定期的實(shí)驗(yàn)需求。

以下是RAW264.7細(xì)胞保存的方法：

1）液氮凍存法：使用離心管收集細(xì)胞，加入1~2ml離心管中，用離心機(jī)旋轉(zhuǎn)離心，除去超自由液。加入封閉的凍存管中，分別加入等體積的FBS和細(xì)胞液氮（-80℃）凍存，可以保存1~2年。

2）24小時(shí)內(nèi)重分化法：使用無菌技術(shù)將RAW264.7細(xì)胞從原始培養(yǎng)并收集，使用新的解聚酶和培養(yǎng)基將細(xì)胞移植到新的培養(yǎng)瓶中，其中較早的幾代可以保存一年。

在進(jìn)行存儲(chǔ)前，需確保使用嚴(yán)格的無菌技術(shù)，單次操作在一個(gè)專用的無菌生物安全柜中進(jìn)行。同時(shí)，還需正確標(biāo)注保存時(shí)間、細(xì)胞類型和編號(hào)，以確保使用時(shí)可以準(zhǔn)確識(shí)別每個(gè)樣品。

總之，RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)需要遵循正確的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，注重?zé)o菌技巧和對(duì)細(xì)胞的密集度和傳代次數(shù)進(jìn)行控制，以保證其穩(wěn)定有效地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。