類器官是體外培養(yǎng)的由干細(xì)胞分化而來的后裔細(xì)胞所形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的三維細(xì)胞復(fù)合體。類器官具有某些與來源器官相似的結(jié)構(gòu)特征和功能特性，而且能夠在體外3D培養(yǎng)體系中穩(wěn)定擴(kuò)增。目前，類器官在生物學(xué)基礎(chǔ)研究，構(gòu)建疾病模型、腫瘤研究、組織再生修復(fù)、基因治療以及藥物篩選等方面顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。接下來分享兩篇青蓮客戶的應(yīng)用案例，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)揭示類器官模型在疾病病理機(jī)制、疾病治療中的重要應(yīng)用價(jià)值。

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案例一

hiPSC衍生的皮膚類器官揭示SARS-CoV-2感染的病理生理學(xué)特征?
新冠病毒可以直接攻擊或間接影響肺、氣管、腸、腎、腦、心臟和皮膚等多個(gè)器官。在新冠病毒大流行期間，多種人類多能干細(xì)胞（ESC/hiPSC）衍生的類器官已被用來建立體外感染模型來研究病毒和宿主的相互作用機(jī)制，并進(jìn)行有效的藥物篩選。2022年03月04日，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院、蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）、中科院武漢病毒所以及華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)聯(lián)合發(fā)表了題為“Establishment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Skin Organoids Enabled Pathophysiological Model of SARS-CoV-2 Infection”的研究論文，且該論文作為該期Advanced Science雜志（IF：16.806）的封面文章刊登。該研究建立了COVID-19患者皮膚的蛋白質(zhì)組圖譜，并研究了人類誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（hiPSC）衍生的具有毛囊和神經(jīng)系統(tǒng)的皮膚類器官對(duì)SARS-CoV-2感染的敏感性。發(fā)現(xiàn)新冠病毒能夠感染皮膚毛囊干細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致毛發(fā)脫落和神經(jīng)元死亡。該研究首次為新冠肺炎和脫發(fā)后遺癥之間的關(guān)聯(lián)提供了證據(jù)，也展現(xiàn)了皮膚類器官在病理機(jī)制研究和藥物篩選方面的巨大潛力和價(jià)值（青蓮百奧承擔(dān)了質(zhì)譜相關(guān)數(shù)據(jù)的產(chǎn)出）。

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臨床COVID-19皮膚樣本的綜合蛋白質(zhì)組學(xué)概況
該研究首先通過病理染色和電鏡在新冠患者皮膚組織中發(fā)現(xiàn)了SARS-CoV-2病毒顆粒的存在，證實(shí)了新冠病毒能夠直接感染皮膚組織。進(jìn)而，通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法構(gòu)建了新冠患者皮膚的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜，并發(fā)現(xiàn)了表皮發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、和包括細(xì)胞外基質(zhì)、焦點(diǎn)黏連、橋粒、黑素小體等多處皮膚重要組織微環(huán)境的生物學(xué)過程受到了嚴(yán)重影響。

hiPSC衍生的皮膚類器官的建立

研究團(tuán)隊(duì)使用hiPSC構(gòu)建了皮膚類器官模型。為了進(jìn)一步證明皮膚類器官類似于人體皮膚組織的生理功能，對(duì)培養(yǎng)后第140天建立的成熟皮膚類器官進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)特征分析。結(jié)果顯示，在這些器官中鑒定出的蛋白質(zhì)主要富集在表皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和血管相關(guān)細(xì)胞中（圖2a）。生物過程分析表明，從皮膚類器官中鑒定出的蛋白質(zhì)主要富集在表皮發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和干細(xì)胞分裂等皮膚發(fā)育過程中（圖2b）。在皮膚類器官中發(fā)現(xiàn)了幾種信號(hào)通路，包括經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt、表皮生長(zhǎng)因子受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）以及與皮膚發(fā)育相關(guān)的TGF β和TGFg。特別是，在皮膚類器官中發(fā)現(xiàn)了與表皮發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)參與了皮膚屏障（例如KRT1和KRT16）、上皮細(xì)胞分化（例如KRT14和KRT4）和黑素體的建立過程（圖2c）。此外，還鑒定到了核心ECM蛋白，如15種膠原蛋白、31種糖蛋白和10種蛋白聚糖以及多種重要的生長(zhǎng)因子。這些結(jié)果表明，作者已成功構(gòu)建了具有多種結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能的皮膚類器官。

SARS-CoV-2可以感染毛囊和皮膚的神經(jīng)系統(tǒng)
接下來通過SARS-CoV-2體外感染皮膚類器官，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2主要靶向KRT17+毛囊細(xì)胞，對(duì)KRT71+和PDGFRα+毛囊細(xì)胞靶向作用較少。SARS-CoV-2感染導(dǎo)致類器官中KRT17 +毛囊周圍表皮細(xì)胞的上皮形態(tài)消失，細(xì)胞增殖能力下降，研究發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象是由于SARS-CoV-2感染使得毛囊周圍表皮細(xì)胞核的H2A.X磷酸化而導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂，從而引起DNA損傷和氧化應(yīng)激而損傷毛囊干細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，毛囊周圍的神經(jīng)元細(xì)胞和雪旺樣細(xì)胞相繼被感染，而神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞等多種神經(jīng)細(xì)胞類型的細(xì)胞形態(tài)和功能蛋白均受到嚴(yán)重影響。

總結(jié)

該研究利用COVID-19的皮膚樣本以及體外類器官感染模型揭示了SARS-CoV-2能夠直接感染皮膚的毛囊和神經(jīng)系統(tǒng)以及SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的皮膚不同結(jié)構(gòu)病變的致病機(jī)制。為后續(xù)研究COVID-19患者皮膚的SARS-CoV-2感染機(jī)制和藥物篩選提供了指導(dǎo)。

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案例二

iPSC衍生的類器官模型在局限性硬皮病治療中的應(yīng)用

局限性硬皮?。↙oS）是一種罕見的慢性疾病，具有廣泛的組織纖維化、炎性浸潤(rùn)、微血管改變和表皮附件病變特征。然而，目前對(duì)LoS的發(fā)病機(jī)制和治療策略的深入了解是有限的。2022年03月22日，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院、蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）、應(yīng)急防控藥物工程技術(shù)研究中心研究團(tuán)隊(duì)在Advanced Science雜志（IF：16.806）上聯(lián)合發(fā)表了題為“Application of an iPSC-Derived Organoid Model for Localized Scleroderma Therapy”的研究論文。該研究建立了LoS皮膚的蛋白質(zhì)組圖譜，并對(duì)LoS皮膚的病理特征進(jìn)行了表征。然后創(chuàng)建了人源誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞來源的上皮和間充質(zhì)（EM）類器官模型對(duì)LoS小鼠進(jìn)行類器官移植治療，發(fā)現(xiàn)該策略可以顯著減輕皮膚纖維化的程度，增強(qiáng)皮膚中表皮干細(xì)胞的活性，并促進(jìn)汗腺和血管的再生。這些結(jié)果突出了EM類器官模型在促進(jìn)硬皮病相關(guān)表型和皮膚相關(guān)功能恢復(fù)方面的潛在應(yīng)用（青蓮承擔(dān)了類器官蛋白質(zhì)組質(zhì)譜數(shù)據(jù)的產(chǎn)出）。

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通過注射博萊霉素1個(gè)月建立局限性硬皮?。↙oS）小鼠模型。使用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析硬皮病皮膚組織的病理特征，結(jié)果顯示硬皮病小鼠皮膚微環(huán)境調(diào)節(jié)因子顯著失調(diào)。接下來應(yīng)用iPSC生成EM類器官。并對(duì)第16天的EM類器官進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示研究者已成功構(gòu)建了由MSCs、上皮細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞類型組成的具有不同細(xì)胞功能的EM類器官。接下來，應(yīng)用EM類器官對(duì)硬皮病小鼠進(jìn)行移植治療。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，共有614個(gè)蛋白質(zhì)在治療組和硬皮病組之間差異表達(dá)（圖4a）。進(jìn)一步分析集中在硬皮病中差異表達(dá)，經(jīng)類器官治療后表現(xiàn)出恢復(fù)表達(dá)的蛋白（圖4b）。這些蛋白質(zhì)在肌肉收縮和發(fā)育、肌原纖維組裝和ATP代謝的生物過程中高度富集，表明EM類器官治療有效地改善了肌肉纖維化（圖4c）。病理染色也顯示，經(jīng)EM類器官治療后，硬皮病小鼠皮膚組織中纖維化標(biāo)志物（α-SMA、VIM和EN1）的表達(dá)顯著下調(diào)（圖4d，e）。此外，治療后炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明，EM類器官可以改善硬皮病小鼠的皮膚纖維化和炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步免疫熒光染色還顯示了EM類器官處理的硬皮病小鼠皮膚中出現(xiàn)汗腺再生（圖4f），以及表層受損血管的明顯再生（圖4g）。

總結(jié)

綜上所述，該研究基于LoS的病理特征構(gòu)建了由iPSC衍生的EM類器官，并利用蛋白質(zhì)組學(xué)和病理特征分析，對(duì)EM類器官促進(jìn)硬皮病的病理表型和皮膚相關(guān)功能的恢復(fù)提供了明確的證據(jù)，為從再生醫(yī)學(xué)的角度治療硬皮病提供了一種新的可行性治療策略。