? 計算表達量可以用 StringTie、Htseq-count或featureCount ，第一次做轉錄組分析時，參照了一篇Cell的子刊文章的分析方法，里面使用的STAR+featureCount，就直接用了這個軟件，也就沒再使用別的，回頭看第一次使用時，發(fā)現(xiàn)好多細節(jié)沒有注意到，溫故而知新。featureCount是subread軟件包里的一個命令，所以安裝subread即可。而subread又有命令行版和R版，有服務器，自然選擇命令行版了。

featureCounts，有兩個核心概念：

?????? Feature: 指的是基因組區(qū)間的最小單位，比如exon;

?????? Metafeature: 可以看做是許多的feature構成的區(qū)間，比如屬于同一個gene的外顯子的組合。

?????? 在定量的時候，支持對單個feature 定量(對外顯子定量), 也支持對meta-feature進行定量(對基因進行定量)。當reads比對到2個或者以上的features 時，默認情況下，featureCounts在統(tǒng)計時會忽略到這部分reads, 如果你想要統(tǒng)計上這部分reads,可以添加-O 參數(shù)，此時一條reads 比對到多個feature，每個feature 定量時，都會加1。對于meta-features來說，如果比對到多個features 屬于同一個 meta-features(比如一條reads比對到了exon, 但這些exon屬于同一個gene), 則對于這個gene 而言，只會計數(shù)1次。總之，不管對于feature 還是meta-feature,只有比對多個不同的區(qū)間時，才會分別計數(shù)。

一、軟件下載及安裝：

??首先是官方網(wǎng)站

? ? ? ? https://sourceforge.net/projects/subread/

? ? ? ? http://subread.sourceforge.net

下載subread-2.0.3-Linux-x86_64.tar.gz壓縮文件，tar -zxvf進行解壓,進入bin/目錄，目錄下featureCounts就可直接運行，簡直不能再友好了：

二、參數(shù)說明：

-a 指定注釋文件

-o 指定結果輸出目錄及文件名

-p 能用在paired-end的情況中，會統(tǒng)計fragment而不統(tǒng)計read

-t 指定feature的類型，默認是exon，當然gtf里面還有gene、CDS或者直接以feature命名的分類方式。

其它參數(shù)：

?-f參數(shù) ?該參數(shù)設置后統(tǒng)計的是feature層面（默認是exon）的參數(shù)，如果不設置則是直接統(tǒng)計meta-feature參數(shù)（即一個gene中的多個exon）

第一種：一開始我沒有設置-f 參數(shù)，只是這樣設置-t exon, 結果如下圖：

這時按exon分類進行統(tǒng)計，但是由于沒有設置-f，在同一個gene內(nèi)的exon會被統(tǒng)計成一個meta-feature，但是每個exon仍然會被顯示出來，遇到一個gene有多個exon的時候看著就很亂。

第二種：然后我加上-f，這樣設置-t exon -f , 看一下結果：

??這種設置將一個基因的每個exon單獨列出，wc-l后有76749行內(nèi)容。

第三種：再設置 -t gene -f，wc -l 后有25654行內(nèi)容，如下圖：

???我現(xiàn)在還不確定-f參數(shù)及-t參數(shù)對后面差異表達會不會有影響，初步判斷不會的，但我注意到，-t gene -f設置后，count計數(shù)基于gene 層面，就不會出現(xiàn)相同基因的不同外顯子count值，也就是第一列不會出現(xiàn)重復，并且可以直接得到基因信息，避免了注釋、刪除重復這個過程，我們做轉錄組測序，不就是想看基因水平的變化嗎，我覺得這是很好的一個參數(shù)設置，不知道為什么網(wǎng)上一堆的帖子都沒有這樣設置，官網(wǎng)上示例也只是-t exon。希望未來有人和我討論一下這個問題。

最終：我基于自己的理解，加上-t gene -f參數(shù)了。

三、結果

1、運行過程情況：

Successfully assignedalignments: 14212190 (32.7%), 說明只有32.7的paired reads 定量到了基因上，如果想知道那些沒有分配上的reads是出于什么原因，則可看下圖，輸出中的summary文件。

? ? ?Unmapped: 沒有比對上； ????

?????MultiMapping:多個序列比對在有限的序列區(qū)域上，即參考組上有多個匹配點；?

? ? ?NoFeatures: 其比對與任何基因都不重疊；?

? ? ?ambiguous: 其比對與多個基因重疊。

2. 合并不同樣本的count文件：

? ? ? ? join count1.txt count2.txt > count_12.txt

? ? ? ??或者先提取出來每個樣本的第一列和第七列信息，再通過join合并

? ? ? ? cut -f 1,7 count1.txt | grep -v ‘^#’ >count1_cut.txt

這樣就能得到所有的樣本的Count矩陣了。

總結：使用這個工具時要根據(jù)不同的項目，不同的目的，參數(shù)也要進行適當?shù)恼{(diào)整，尤其是模式生物和非模式生物研究時，一定要想想?yún)?shù)設置合適不合適，我不認為寫好了一個流程，就可以用來做所有課題的轉錄組分析了。這也是自己會和交給公司來做最大的好處了，自己的課題，只有自己才能對數(shù)據(jù)結果負責。

附：

STAR有一個參數(shù)-quantMode，可以指定--quantMode GeneCounts輸出STAR計算出的reads計數(shù)結果，如果是比對完之后未做轉錄本拼裝，直接對已知基因（構建基因組索引時GTF中囊括的基因）進行定量時，完全不需要再次用featureCounts或HTSeq再計算reads count。以后試試。

?

參考：

https://www.jianshu.com/p/9cc4e8657d62

http://www.360doc.com/content/21/0714/12/76149697_986499746.shtml

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24227677/

http://subread.sourceforge.net/featureCounts.html

http://subread.sourceforge.net/RNAseqCaseStudy.html

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