小鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)步驟
1、??于無菌條件下切取鼠頭并以75%酒精浸泡1min，解剖出完整鼠腦；
2、??預冷解剖液中分離去除軟膜、血管、取大腦皮質漂洗，用眼科剪將皮質反復剪切成碎塊；
3、??移入培養(yǎng)皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2m1，37℃培養(yǎng)箱中消化30min；
4、??將皮層組織碎塊移入離心管，棄去剩余消化液，用接種液洗3次，每次洗滌后使組織塊充分沉降到試管底，棄去上清液；
5、??最后再用接種液1ml混懸，反復吹打（巴氏吸管）混懸液中組織塊，力度適中，至渾濁后將上清液移入培養(yǎng)瓶待用；
6、??加入1ml接種液后再次吹打，如此反復3-4次，組織塊逐漸消化后，棄去最終殘塊；
7、??收集含單細胞懸液的上清液約4-5ml于培養(yǎng)瓶中，以接種液重新懸浮細胞，細胞記數(shù)；接種1x107個細胞于6孔培養(yǎng)板中；
8、??培養(yǎng)24h至細胞貼壁后，換全培養(yǎng)液（DMEM/F12+2%B27）培養(yǎng)3d，觀察神經(jīng)元生長狀況；
9、??換用阿糖胞苷培養(yǎng)液(終濃度2.5ug/ml，換半液)培養(yǎng)3d以抑制神經(jīng)膠質細胞及雜細胞生長，獲得單純培養(yǎng)的原代神經(jīng)細胞；
10、??每隔3d換全培養(yǎng)液1次，每次換半液。

神經(jīng)元免疫化學鑒定

1、4%多聚甲醛固定細胞30min，PBS洗滌3次；
2、加入無水甲醇:30%雙氧水（5:1）處理30min，PBS洗滌3次；
3、加入5%羊血清封閉20min，棄去多余液體；
4、加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神經(jīng)元特異性烯醇化酶），培養(yǎng)箱中孵育2-4h，PBS洗滌3次；
5、加入Cy3-羊抗兔IgG（1:50）和20μl抗熒光衰減封片劑，室溫放置1h；
6、加入DAPI染液（1:40），室溫放置5-10min；PBS洗滌3次。
7、熒光顯微鏡觀察；