前言

中風(fēng)是成人致殘的主要原因，其中大部分是由腦梗塞引起的。區(qū)分缺血性卒中患者(IS)和模擬卒中患者(SMS)是很重要的，因為錯誤的分類可能會導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)母深A(yù)，阻止有效的治療，以及資源的低效分配，如卒中單元護理。多模式計算機斷層掃描(CT)的常規(guī)診斷在區(qū)分IS和SMS方面的能力有限。因此，對新型診斷標(biāo)記物的需求很大。循環(huán)代謝組靈敏地捕捉多個器官的病理生理事件，因此可能反映與急性IS相關(guān)的事件，如腦損傷、全身反應(yīng)(如應(yīng)激)和血管內(nèi)的過程。

本篇，作者使用非靶向代謝組學(xué)的發(fā)現(xiàn)-驗證方法來識別能夠區(qū)分IS和SM的代謝物。作者進一步進行了系統(tǒng)的文獻回顧，以確定在癥狀出現(xiàn)后的24小時內(nèi)與IS相關(guān)的循環(huán)代謝物，并評估相關(guān)代謝物的診斷價值。

本篇由來自于德國慕尼黑大學(xué)中風(fēng)和癡呆癥研究所斯蒂芬·蒂德博士在ANNALS OF NEUROLOGY期刊（IF:11.274）發(fā)表了題為 的研究成果，通過代謝組學(xué)研究方法，發(fā)現(xiàn)了不對稱和對稱的二甲基精氨酸、孕烯醇酮硫酸鹽和腺苷特征這四種代謝產(chǎn)物可以更好地鑒別急性缺血性卒中與擬卒中，優(yōu)于常規(guī)診斷的多模式顱腦CT(CT；AUC=0.80)和樣本中檢測到的先前發(fā)表的代謝物集合。這一組與中風(fēng)病理生理學(xué)相關(guān)的已知生物學(xué)效應(yīng)的4種代謝物，可以在患者到達醫(yī)院時識別IS患者，從而鼓勵進一步深入的研究，為性缺血性卒中與擬卒中鑒別提供相關(guān)的診斷價值。

研究方法

1. 實驗分組/研究材料

（1） 1期實驗（發(fā)現(xiàn)階段）：正常對照組NC；卒中患者組IS

（2） 2期實驗（驗證階段）：正常對照組NC；卒中患者組IS

（3） 3期實驗（推導(dǎo)階段）：模擬卒中組SM；卒中患者組IS（2期樣本）

（4） 4期實驗（驗證階段）：模擬卒中組SM；卒中患者組IS

（5） 5期實驗（重復(fù)階段）：模擬卒中組SM；卒中患者組IS

2.技術(shù)路線

2.1 生理/病理分析：醫(yī)院常規(guī)項目檢查、家族病史調(diào)查、CT檢查、NIHSS美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表評分、磁共振成像(MRI)檢查

2.2 代謝組學(xué)：LC-MS 非靶標(biāo)代謝組分析

2.3 統(tǒng)計分析：常規(guī)數(shù)據(jù)統(tǒng)計、兩階段遞增法、5次重復(fù)的10倍交叉驗證、多元線性回歸模型、支持向量機、線性判別分析、10000棵樹200次運行的隨機森林、K近臨分析、樸素貝葉斯、邏輯回歸

研究結(jié)果

1.第1期（發(fā)現(xiàn)階段）篩選出49種代謝物，其中通過第2期（驗證階段）篩出有41種

在發(fā)現(xiàn)階段樣本(1期)的689個測定代謝物中，不到50%的樣本檢測到180個代謝物，剩下509個代謝物進行分析。將IS患者與NC患者進行比較，發(fā)現(xiàn)樣本中有49種代謝物符合預(yù)先指定的統(tǒng)計意義標(biāo)準(zhǔn)(1期；見圖1A、表1B)。在驗證階段樣本(2期)中，其中41種也符合這些標(biāo)準(zhǔn)，包括16種脂肪酸，類固醇皮質(zhì)醇和孕烯醇酮硫酸鹽，三羧酸(TCA)循環(huán)中間體檸檬酸和蘋果酸(均升高)，脯氨酸，以及核苷腺苷、鳥苷和肌苷。

圖1A | 采用發(fā)現(xiàn)-確認(rèn)方法的抽樣和分析策略對NC、IS和SM樣本進行比較

表1B | 49種代謝物的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，按p值排序

2.六種分類模型中隨機森林的分類效果最好

可以看到六種分類模型（圖1D，SVM：支持向量機、LDA：線性判別分析、RF(10000)*200：10000棵樹200次運行的隨機森林、KNN：K近臨分析、NB：樸素貝葉斯、LR：邏輯回歸）中，隨機森林的分類效果最好，故選擇隨機森林模型。在隨機森林分類中，30種內(nèi)源性代謝物將IS患者與NC區(qū)分開來，曲線下面積(AUC)為0.961(圖1C)。

圖1C | 隨機森林模型的AOC曲線

圖1D | 6種分類模型的AUC對比

3.進一步分析挑選出4種代謝物

隨機森林分類結(jié)果的分層聚類顯示了相當(dāng)大的共線性，特別是在脂肪酸之間(圖2E)，表明分類器中存在冗余。在考慮共線性的情況下為簡化分類器鑒別IS和SM的信息最豐富的代謝產(chǎn)物（圖2A），作者評估了隨機森林條件變量的重要性，發(fā)現(xiàn)不對稱二甲基精氨酸、對稱二甲基精氨酸、孕烯醇酮硫酸鹽和腺苷排名最高(3期)。

圖1E | 隨機森林分類結(jié)果的分層聚類熱圖

圖2A | 隨機森林變量重要性分析排名前10結(jié)果

4.進一步分析挑選出4種代謝物

與多模態(tài)CT相比，這4種代謝物的敏感性為82.5%，特異性為84.9%，其AUC更高(0.90 vs 0.74, 3期;圖2B)。在驗證樣本中也得到了類似的結(jié)果(4期，敏感性:92.4%，特異性:82.9%;圖2C)。通過傾向評分匹配選擇，進一步控制潛在的混雜因素，如人口統(tǒng)計學(xué)、血管危險因素和藥物治療(N = 210;圖2A)，在繼續(xù)招募的復(fù)制樣本中表現(xiàn)依舊更好(第5期，敏感性:88.6%，特異性:72.7%，AUC = 0.90, N = 500;圖2D)。作者進一步進行了2項敏感性分析：第一，排除接受重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)的SM患者;第二，排除接受rt-PA治療后采血的IS患者。兩種分析結(jié)果相似(圖2E)。選定的4種代謝物組也能區(qū)分IS和NC患者(AUC = 0.92;圖2F)。

圖2B | 四種代謝物在3期樣本中的預(yù)測效果

圖2C | 四種代謝物在4期樣本中的預(yù)測效果

圖2D | 四種代謝物在5期樣本中的預(yù)測效果

圖2E | 四種代謝物在4期樣本中的預(yù)測效果（排除rt-PA樣本）

圖2F | 四種代謝物在5期樣本中的預(yù)測效果（排除rt-PA樣本）

5.進一步評估預(yù)示代謝物水平變化與急性事件之間的聯(lián)系

4種診斷代謝物的水平在中風(fēng)后第90天(D90)基本恢復(fù)正常(圖3A)，從而證明了第1天(D1)代謝物水平變化與急性事件之間的聯(lián)系。入院時，心栓塞性卒中患者的SDMA水平(D1)明顯高于大動脈粥樣硬化性卒中和病因不明的卒中患者(圖3B，5期)。孕烯醇酮硫酸鹽水平與梗死體積(β = 0.66, p < 0.0001;圖3C，5期)以及入院時國立衛(wèi)生研究院卒中量表評分(β = 0.47, p = 0.001)顯著相關(guān)。在評估分析前變異性的影響時，作者發(fā)現(xiàn)腺苷水平與分析前樣品處理時間呈負相關(guān)(圖3D，4期)，重要的是，在IS患者和SM患者之間沒有差異(51 vs 51分鐘，p = 0.81)。有94.2%的樣品是在40-70分鐘內(nèi)加工的。

圖3A | 四種代謝物水平在卒中后第90天恢復(fù)到對照水平

圖3B | 不同患者四種代謝物水平在入院時的水平對比

圖3C?| 四種代謝物水平與腦梗塞體積關(guān)系

圖3D | 四種代謝物水平與檢測時間關(guān)系

6.檢索數(shù)據(jù)庫篩選出5項過去研究用于對比

為了將作者的發(fā)現(xiàn)與之前報道的與急性IS相關(guān)的代謝物集聯(lián)系起來，作者進行了一項系統(tǒng)回顧，搜索提供IS患者循環(huán)代謝物數(shù)據(jù)的研究，這些研究僅限于癥狀出現(xiàn)后24小時內(nèi)的血液采樣。在鑒定的3149項記錄中，有5項研究符合選擇標(biāo)準(zhǔn)(表2)。所有研究均為單中心、基于醫(yī)院的研究，比較IS患者與NC患者( 4項研究)或頭痛或眩暈患者(1項研究)。大多數(shù)(4項研究)缺乏獨立樣本的驗證。總的來說，這些研究報告了41種與IS相關(guān)的不同代謝物，研究之間只有1種代謝物重疊。

表2 | 5項過去研究的在當(dāng)前項目中的結(jié)果