非酒精性脂肪肝（NAFLD）是影響全球數(shù)十億人的最常見肝病。NAFLD在全球的患病率為25.24%，兒童群體脂肪肝發(fā)病率也由13%逐年上升至17%，值得注意的是9.8歲以下的患病兒童，內(nèi)臟脂肪組織沒有增加，這表明存在潛在遺傳誘因。鑒于兒童期脂肪變性導(dǎo)致的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝臟疾病和惡性腫瘤的死亡率更高，早期預(yù)測(cè)和檢測(cè)致病性NAFLD是公共衛(wèi)生的首要挑戰(zhàn)。在成年人中，對(duì)NAFLD/NASH的敏感性是高度可變的，并非所有肥胖的人都會(huì)出現(xiàn)脂肪變性，而且大多數(shù)脂肪變性病例不會(huì)發(fā)展為慢性肝病。因此，了解NAFLD/NASH易感人群對(duì)制定預(yù)防和治療策略意義重大。

盡管學(xué)界對(duì)許多疾病的遺傳基礎(chǔ)的理解已經(jīng)取得了進(jìn)展,但目前仍只能解釋一小部分常見疾病病因。當(dāng)遺傳多效性與代謝因素和疾病交叉時(shí)，會(huì)使致病性的遺傳解釋進(jìn)一步復(fù)雜化。NAFLD的主要合并癥是2型糖尿?。═2D），在美國(guó)，根據(jù)年齡組的不同，NAFLD和T2D的合并患病率在32%至90%之間。由于NAFLD和T2D通常存在于同一患者中，所以所識(shí)別出的基因突變是否針對(duì)單一疾病仍不清楚。

葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白（GCKR）rs1260326:C>T單堿基突變（SNP）是之前報(bào)道識(shí)別的突變之一。GCKR幾乎只在肝細(xì)胞中表達(dá)，并被認(rèn)為在葡萄糖利用和脂肪生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白（GCKR）-rs1260326突變與NAFLD的關(guān)系存在廣泛爭(zhēng)議，這種突變似乎可以保護(hù)患者免受糖尿病和慢性腎臟疾病的影響，但與NAFLD和其他疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。因此，完全了解GCKR-rs1260326的多效性作用對(duì)于更深入的診斷和預(yù)后至關(guān)重要，尤其是對(duì)于NAFLD等高度異質(zhì)性代謝疾病。

2022年10月13日，來自美國(guó)Cincinnati Children’s Hospital Medical Center的Takanori Takebe課題組在《Cell》雜志上發(fā)表題為《En masse organoid phenotyping informs metabolic-associated genetic susceptibility to NASH》的文章，就上述問題進(jìn)行技術(shù)革新和細(xì)節(jié)探討。

類器官是一種可以盡可能排除外在復(fù)雜因素并對(duì)基因型和表型進(jìn)行研究的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。近期，從誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）分化而成的代謝相關(guān)細(xì)胞類型研究，已經(jīng)驗(yàn)證了一組人類基因表達(dá)變異信息，如基因表達(dá)定量性狀位點(diǎn)（eQTL）?；陬惼鞴偌夹g(shù)發(fā)展成熟，類器官可以模仿在健康和疾病中活體器官的解剖和生理特征信息。

首先，為了評(píng)估NAFLD基因型-表型相關(guān)性，作者建立一個(gè)由24個(gè)不同基因型的供體iPSC系組成的HLO平臺(tái)。為了加快和促進(jìn)對(duì)24個(gè)供體HLO的比較分析，作者改進(jìn)了iPSC分化方案，通過來自24個(gè)供體的冷凍保存的前腸祖細(xì)胞的混合群體建立了人類群體類器官平臺(tái)（Population organoid Panel，PoP）。通過單細(xì)胞測(cè)序評(píng)估合并HLO的多細(xì)胞組成。與作者之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，改進(jìn)方案也能夠平行產(chǎn)生肝細(xì)胞樣、巨噬細(xì)胞樣和星狀細(xì)胞。為了在PoP-HLOs中產(chǎn)生NAFLD表型，作者用常見的脂肪酸油酸（OA）誘導(dǎo)，OA誘導(dǎo)的PoP模型成功復(fù)制了胰島素不敏感的NASH樣特征，伴隨著糖代謝紊亂、脂肪生成增加、脂肪酸氧化受損和炎癥加劇。接著作者試圖利用活體BODIPY染色成像脂肪定量策略來確定基于類器官的基因型表型關(guān)聯(lián)是否可以預(yù)測(cè)常見的NAFLD相關(guān)SNP基因型。每個(gè)供體攜帶多個(gè)SNP，作者通過比值分析顯示HLO脂質(zhì)積累表型與已報(bào)道存在風(fēng)險(xiǎn)SNPs的關(guān)聯(lián)性，確定了一組非酒精性脂肪肝的核心遺傳因子，包括GCKR rs1260326:C>T。（圖1）

在肝臟中，GCKR與葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合葡糖激酶（GCK），結(jié)合后使GCK失活，部分將GCK保留在細(xì)胞核中。GCKR-rs1260326 TT變體結(jié)合GCK的能力降低，激活肝臟葡萄糖攝取和糖酵解，隨后過量乙酰輔酶a的產(chǎn)生，這是脂肪生成的限速底物。

為了評(píng)估HLO模型中GCKR-rs1260326 TT變體（GCKRTT）的發(fā)病機(jī)制，作者選擇了三種iPSC系，分別為GCKRTT、GCKRCC、GCKRCC>TT（基因編輯），以此專門測(cè)試該SNP的致病影響。研究發(fā)現(xiàn)，GCKRTT和GCKRCC>TT?HLOs中的GCK活性始終高于GCKRCCHLOs。接下來，作者評(píng)估了GCK高活性是否能促進(jìn)新生脂肪生成（DNL）。在沒有外源性脂肪酸負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)高糖和高胰島素培養(yǎng)條件下，第30天BODIPY成像分析顯示，與GCKRCCHLOs相比，GCKRTT和GCKRCC>TT?HLOs產(chǎn)生和積累的脂滴顯著更多。因此，GCKR-rs1260326 TT變體可促進(jìn)GCK酶的活性、脂滴的形成和不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸的積累。（圖2）

作者發(fā)現(xiàn)，在sHLO模型和高度可變的臨床報(bào)告之間，GCKRTT變體的代謝影響存在差異，即在評(píng)估GCKR-rs1260326等位基因的臨床數(shù)據(jù)時(shí)，是否應(yīng)該考慮其他共病代謝特征，如糖尿病癥狀。為了進(jìn)行活體評(píng)估，作者對(duì)1091名被診斷為NASH的成年人隊(duì)列進(jìn)行了回顧性分析，隊(duì)列中NAFLD臨床參數(shù)和遺傳風(fēng)險(xiǎn)變體之間的相關(guān)性分析集中在GCKR-rs1260326變體上。對(duì)NASH臨床隊(duì)列的分析顯示，在攜帶GCKRTT變體的患者中，當(dāng)糖化血紅蛋白HbA1c值在正常<5.7%范圍內(nèi)時(shí)，NAFLD活性評(píng)分[NAS]、小葉炎癥[LI]、脂肪變性活性和纖維化[SAF]評(píng)分明顯優(yōu)于參考GCKRCC。與此形成鮮明對(duì)比的是，當(dāng)HbA1c值>6.4%即糖尿病的范圍內(nèi)時(shí)，GCKRTT的各項(xiàng)評(píng)分高于其他GCKRCC隊(duì)列，即GCKR-rs1260326-T等位基因僅在糖尿病狀態(tài)下可提高疾病的嚴(yán)重程度。值得注意的是，當(dāng)將非糖尿病與糖尿病的亞組進(jìn)行比較時(shí)，NAFLD/NASH炎癥病理學(xué)的惡化在GCKRTT組中最為明顯，而對(duì)于GCKRCC變體，糖尿病HbA1c>6.4%的情況不會(huì)惡化炎癥病理，但有改善（較低）評(píng)分的趨勢(shì)。因此，對(duì)于攜帶GCKRTT變體的患者，HbA1c測(cè)量可能對(duì)描述NAFLD相關(guān)炎癥病理的嚴(yán)重程度具有預(yù)測(cè)價(jià)值。（圖3）

為了評(píng)估GCKRTT對(duì)細(xì)胞的影響，作者對(duì)來自基因型患者肝細(xì)胞樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行了無堿基轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。差異分析發(fā)現(xiàn)在GCKRTTNASH肝細(xì)胞中，與GCKRCTGCKRCC肝細(xì)胞相比，脂肪生成基因、炎癥相關(guān)基因顯著上調(diào)，這與比較GCKRCCandTT的OA誘導(dǎo)的sHLO模型顯著一致。有趣的是，下調(diào)的基因包括線粒體ATP合成酶的多個(gè)亞基，于是作者試圖驗(yàn)證其HLO模型中線粒體功能是否受到干擾。作者發(fā)現(xiàn)，與GCKRTT?HLO相比，GCKRTT?sHLO的耗氧率（OCR）顯著降低。此外，與GCKRCC?sHLO相比，在GCKRTT?sHLO中ATP/AMP比率顯著降低。與GCKRCC?sHLO相比，這些結(jié)果與GCKRTT?sHLO中通過活細(xì)胞染色定量的ROS增強(qiáng)一致。因此作者認(rèn)為線粒體失調(diào)是GCKRTT變體細(xì)胞中ROS積累所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激增強(qiáng)的結(jié)果，脂肪酸積累加劇了氧化應(yīng)激。（圖4）

二甲雙胍是用于治療與肥胖相關(guān)的T2D的一種藥物，然而與攜帶GCKRCCorCT的患者相比，攜帶GCKRTT的患者在二甲雙胍治療48周后，多項(xiàng)T2D指標(biāo)沒有改善。作者為了驗(yàn)證HLO模型是否反映了這些活體觀察結(jié)果，評(píng)估了二甲雙胍治療sHLO的效果，并評(píng)估了控制GCKRTT?sHLO中ROS升高是否可以更好地調(diào)節(jié)過量脂肪酸積累的不良影響。

在控制不必要的ROS生成的機(jī)制中，作者專注于解耦氧化磷酸化過程，具體而言，GCKRTT?sHLO補(bǔ)充了NAD+前體煙酰胺核糖（NR）和硝唑嗪（NTZ），最近被證明能增強(qiáng)線粒體功能。作者首先證明了NR和NTZ在GCKRTT?HLO系統(tǒng)中的作用，NR和NTZ聯(lián)合處理逆轉(zhuǎn)了GCKRTT?sHLO組OCR水平，恢復(fù)能量消耗，是由于NR和NTZin的協(xié)同作用增加了NAD+的可用性，同時(shí)DNL和脂肪酸誘導(dǎo)的炎癥基因表達(dá)受到抑制。相反，二甲雙胍治療在實(shí)際上增加了ROS，這可能會(huì)加劇疾病表型?？偟膩碚f，GCKRTT變體和脂肪酸暴露引起的線粒體功能障礙的易感性可以通過氧化性解偶聯(lián)來減輕，該解偶聯(lián)允許適度增加的脂肪酸供應(yīng)，同時(shí)提供抗氧化應(yīng)激保護(hù)。（圖5）

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是影響全球數(shù)十億人的最常見肝病。NAFLD在全球的患病率為25.24%，兒童群體脂肪肝發(fā)病率也由13%逐年上升至17%，值得注意的是9.8歲以下的患病兒童，內(nèi)臟脂肪組織沒有增加，這表明存在潛在遺傳誘因。鑒于兒童期脂肪變性導(dǎo)致的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝臟疾病和惡性腫瘤的死亡率更高，早期預(yù)測(cè)和檢測(cè)致病性NAFLD是公共衛(wèi)生的首要挑戰(zhàn)。在成年人中，對(duì)NAFLD/NASH的敏感性是高度可變的，并非所有肥胖的人都會(huì)出現(xiàn)脂肪變性，而且大多數(shù)脂肪變性病例不會(huì)發(fā)展為慢性肝病。因此，了解NAFLD/NASH易感人群對(duì)制定預(yù)防和治療策略意義重大。