中藥作為民族瑰寶，已應(yīng)用了數(shù)千年。揭示中藥單體的作用靶點和作用機(jī)制，可大大提高新藥的發(fā)現(xiàn)速度和中藥的接受程度。小檗堿（BBR），與二甲雙胍、阿司匹林等被并稱為“神藥”，藥理活性廣泛。除傳統(tǒng)的抗痢疾桿菌活性外，小檗堿在II型糖尿病、高脂血癥、阿爾茲海默癥等方面的新生物學(xué)作用逐漸被發(fā)現(xiàn)和闡明。基于此，BBR的直接靶標(biāo)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但其復(fù)雜而巧妙的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制尚未完全闡明，如果能闡明BBR的關(guān)鍵靶點，不僅有助于我們理解生物進(jìn)化的本質(zhì)，也能為新藥的發(fā)現(xiàn)提供“可成藥”的靶點。

2022年12月14日，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所宋丹青團(tuán)隊在《Acta Pharmaceutica Sinica B》（IF=14.903）發(fā)表了題為：“Discovery and identification of EIF2AK2 as a direct key target of berberine for anti-inflammatory effects”的研究論文，該團(tuán)隊使用全新的BBR二苯酮光親和探針，通過基于活性的蛋白質(zhì)組分析技術(shù)（ABPP）尋找抗炎的關(guān)鍵靶點。他們首先通過多學(xué)科交叉的手段，首次發(fā)現(xiàn)并驗證EIF2AK2（也稱為PKR）、eEF1A1、PRDX3和VPS4B作為BBR的直接靶點，發(fā)揮協(xié)同抗炎作用。其中，BBR通過離子鍵與EIF2AK2強(qiáng)結(jié)合，并通過EIF2AK2同時調(diào)控多種炎癥通路，表明EIF2AK2是BBR抗炎作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。此外，BBR可以巧妙地抑制EIF2AK2二聚體形成而不是直接抑制其酶活性，并選擇性抑制JNK、NF-κB、AKT和NLRP3等多種信號通路，具有良好的安全性。體內(nèi)研究進(jìn)一步證實，BBR以EIF2AK2依賴性方式抑制炎癥反應(yīng)，因此，抑制EIF2AK2二聚體形成可能成為治療炎癥等相關(guān)疾病的重要靶點。值得注意的是，本研究使用了漢恒生物提供的敲低EIF2KA2的腺相關(guān)病毒（AAV）。

下面，我們一起來看具體的研究結(jié)果：

首先，作者在THP-1細(xì)胞中篩選并評估了BBR靶標(biāo)的熒光標(biāo)記，最終選擇了11b作為功能性探針，通過生信分析以及11b探針下拉實驗表明，EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B這4種蛋白為BBR的潛在直接靶蛋白。

圖1.靶蛋白捕獲和功能分析

然后，作者用CETSA實驗驗證BBR與4種靶蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)添加溫度為35~75℃之間的BBR，四種蛋白的熱穩(wěn)定性均有不同程度的增強(qiáng)，表明BBR與這四種蛋白質(zhì)之間可能存在直接相互作用。作者用SPR分析并使用軟件對BBR與4種蛋白進(jìn)行分子對接，再次驗證了BBR與這四種靶蛋白之間的特異性相互作用，而EIF2AK2與BBR的親和力最強(qiáng)。

圖2.BBR與其潛在靶標(biāo)之間的親和力研究

由于EIF2AK2可以調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并參與多種炎癥相關(guān)疾病的調(diào)控，因此作者對EIF2AK2與BBR的相互作用模式和抗炎功能進(jìn)行了深入研究?；贓IF2AK2與BBR之間的強(qiáng)親和力，作者推測它們之間可能存在離子鍵，故選擇了兩個含有不同離子鍵相互作用的空腔，使用軟件進(jìn)行分子對接并結(jié)合氨基酸單點突變進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果表明，BBR可能直接靶向EIF2AK2的二聚化以調(diào)節(jié)抗炎作用。作者接著用免疫沉淀的方法進(jìn)一步驗證了BBR確實干擾EIF2AK2二聚化。直接靶向EIF2AK2二聚化或自磷酸化可能會導(dǎo)致不同的下游效應(yīng)，為了進(jìn)一步了解這種差異，作者用EIF2AK2自磷酸化抑制劑C16來測定EIF2AK2的抑制活性，結(jié)果表明，BBR可以通過靶向EIF2AK2二聚反應(yīng)選擇性地發(fā)揮相關(guān)活性來避免可能的毒性，說明BBR具有良好的安全性。

圖3.EIF2AK2的功能研究

為了進(jìn)一步了解EIF2AK2的功能作用，作者通過測量PMA-THP-1細(xì)胞中的IL-1β釋放來驗證NLRP3炎癥小體的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BBR可能通過作用于EIF2AK2來抑制NLRP3表達(dá)和IL-1β的釋放。由于EIF2AK2在腦組織中表達(dá)相對較高，作者進(jìn)一步驗證了EIF2AK2與人源性小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥通路之間的相關(guān)性，正如預(yù)期，BBR可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的p-NF-κB p65和p-JNK的升高，而BBR抑制p-NF-κB p65和p-JNK的作用在EIF2AK2被敲低后部分或完全喪失。但當(dāng)EIF2AK2過表達(dá)時，p-NF-κB p65和p-JNK的BBR依賴性抑制被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明BBR可通過靶向EIF2AK2來影響腦炎癥反應(yīng)，并揭示了BBR在大腦中發(fā)揮抗炎作用的可能機(jī)制。此外，BBR可以抑制棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)的p-JNK水平上升，并上調(diào)HepG2細(xì)胞中SIRT1蛋白的表達(dá)，其中SIRT1是與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的重要生物標(biāo)志物，結(jié)果進(jìn)一步表明，BBR可能通過與關(guān)鍵蛋白EIF2AK2結(jié)合來調(diào)節(jié)炎癥誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂。

圖4.BBR靶點的功能研究

此外，作者選擇了4個BBR靶標(biāo)的經(jīng)典驗證相關(guān)途徑進(jìn)行功能驗證，作者建立了這4種蛋白質(zhì)在細(xì)胞水平上的過表達(dá)或敲低模型，以研究BBR是否以依賴性方式調(diào)節(jié)不同的經(jīng)典炎癥途徑，如JNK，NF-κB，MAPK和AKT信號。通過一系列WB實驗表明，BBR分別通過EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B依賴方式調(diào)節(jié)JNK、NF-κB、MAPK和AKT等多種信號通路，其中EIF2AK2起主導(dǎo)作用，隨后，作者進(jìn)行了體內(nèi)實驗來進(jìn)一步確認(rèn)。

圖5.EIF2AK2體內(nèi)功能驗證

由于IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的分泌與炎癥小體NLRP3的表達(dá)、JNK和NF-κB通路的激活等密切相關(guān)，作者進(jìn)一步論證了BBR是否通過靶向EIF2AK2來影響IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的體內(nèi)釋放。通過小鼠尾靜脈注射腺相關(guān)病毒AAV-shEIF2KA2-GFP 成功建立了EIF2KA2敲低小鼠模型，以評估BBR對IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的影響。結(jié)果顯示，BBR顯著降低了對照組IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的產(chǎn)生，而BBR的作用在EIF2AK2敲低組中減弱，肝臟的H&E染色結(jié)果表明，BBR可減輕EIF2AK2敲低小鼠的肝臟組織的炎癥浸潤。簡言之，BBR可能通過靶向EIF2AK2下調(diào)IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的分泌，具有良好的安全性。

圖6.BBR抗炎機(jī)制圖

綜上所述，作者確定了EIF2AK2可調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括AKT、JNK和NF-κB通路。同時，四個新確定的BBR抗炎作用的直接靶標(biāo)（eEF1A1，PRDX3和VPS4B，EIF2AK2）是治療幾種炎癥相關(guān)疾病的關(guān)鍵靶點，由于BBR通過多靶點網(wǎng)絡(luò)機(jī)制發(fā)揮其多樣化的藥理活性，因此需要進(jìn)一步探索更直接的靶點，明確每個靶點的貢獻(xiàn)，以充分闡明復(fù)雜而巧妙的基因間的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制以及相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。此外，BBR能直接抑制EIF2AK2的二聚化，發(fā)揮協(xié)同抗炎作用，具有良好的安全性，因此，抑制EIF2AK2二聚化可能是炎癥相關(guān)疾病的重要治療靶點。