藥物致腎小管間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型【免疫熒光代做】

【造模機(jī)制】腺嘌呤體內(nèi)氯化物 2,8—二羥基腺嘌呤以不溶性結(jié)晶的形式大量沉積于腎小管,造成腎小管部分?jǐn)U張,部分變性壞死,間質(zhì)淋巴和單核細(xì)胞浸潤(rùn),病變晚期可見(jiàn)2,8—二羥基腺嘌呤結(jié)晶周?chē)罅咳庋磕[樣增生結(jié)節(jié)形成,腎間質(zhì)廣泛纖維化。

【造模方法】

1.動(dòng)物和器材、試劑選用 Wistar 雄性大鼠,體重 150～200g,適應(yīng)環(huán)境 1 周后,隨機(jī)分組。分籠飼養(yǎng),自由飲食。造模前將腺嘌呤(adenine,為上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)以 2%淀粉溶液溶解,制成混懸液。

2.模型制備模型組以 150mg/kg 腺嘌呤混懸液灌胃,對(duì)照組以腺嘌呤相同體積淀粉落液灌胃。每日灌胃 1次,連續(xù) 17周。3.樣本采集和指標(biāo)測(cè)定分別于第 3 周、第 7 周、第 12 周、第 17 周四個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲動(dòng)物樣本,進(jìn)行功能學(xué),組織學(xué),免疫組化檢測(cè)與觀察。

(1)功能學(xué)檢查:將動(dòng)物置于代謝籠收集 24 小時(shí)尿液,采用考馬斯亮藍(lán)法在 UV755B分光光度計(jì)上比色測(cè)定 24 小時(shí)尿蛋白含量;利用底物法在 UV755B 分光光度計(jì)測(cè)定尿中尿N-乙酰丹-葡萄糖苷酶(NAG 酶)。分別在上述時(shí)間點(diǎn)從眶靜脈叢取靜脈血,采用 Beck-man CX-7 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中 Ser和 BUN。

(2)組織學(xué)觀察:實(shí)驗(yàn)第7周、第 12 周、第 17 周分別收獲動(dòng)物各 10 只。取腎組織置于10%多聚甲醛中固定 24 小時(shí),常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋,3pl 切片,行 HE常規(guī)染色和 Masson 特染。光鏡下在 IDA-2000 高清晰度數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)下計(jì)算腎間質(zhì)纖維化指數(shù)。高倍鏡(×200)下隨機(jī)選取 10 個(gè)不重疊視野測(cè)定間質(zhì)纖維化而積與同視野小管間質(zhì)總面積的百分比。免疫組化實(shí)驗(yàn)各組腎組織常規(guī)10%甲醛固定,石蠟包埋,3μl 切片,多聚L 賴(lài)氨酸處理過(guò)的載玻片貼片,58℃下烤片。利用 SABC試劑盒進(jìn)行免疫組化染色。

【模型特點(diǎn)】

1.病變典型,時(shí)相性強(qiáng)造模 1～3 周模型組大鼠可見(jiàn) 2,8—二羥基腺嘌呤結(jié)晶明顯,多位于近曲小管管腔內(nèi)。受累腎小管上游各段擴(kuò)張,上皮細(xì)胞變性、壞死,間質(zhì)彌漫淋巴和單核細(xì)胞浸潤(rùn)。病變第 4～7 周,各級(jí)腎小管彌漫擴(kuò)張,上皮細(xì)胞萎縮和再生明顯,2.8—二羥基腺嘌呤結(jié)晶沉積處單核吞噬細(xì)胞及大量成纖維細(xì)胞增生。可見(jiàn) 2,8—二羥基腺嘌呤結(jié)晶周?chē)鷨魏送淌杉?xì)胞增生的結(jié)節(jié)狀病變廣泛形成。第 12 周時(shí),腎小管上皮空泡或顆粒性變性,局灶性小管擴(kuò)張明顯,基底膜斷裂,小管間質(zhì)區(qū)域增寬,纖維化明顯。至第 17 周時(shí),可見(jiàn)腎小管明顯萎縮及消失,伴代償性擴(kuò)張,間質(zhì)廣泛纖維化。發(fā)生發(fā)展有規(guī)律性,隨著病情進(jìn)展腎功能持續(xù)惡化;小管間質(zhì)損傷由早期的間質(zhì)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn),腎小管上皮細(xì)胞變性、脫落,小管擴(kuò)張上皮細(xì)胞萎縮或再生逐漸進(jìn)展到腎小管明顯萎縮及消失,小管代償性擴(kuò)張,間質(zhì)廣泛性纖維化。

2.可控性好,成功率近 100%通過(guò)嚴(yán)格控制腺嘌呤的給藥劑量,在加快病變進(jìn)程的同時(shí),可通過(guò)給藥量的適當(dāng)變化控制動(dòng)物模型的發(fā)展,使 TIF 模型復(fù)制的成功率接近100%。

【應(yīng)用范圍】研究腎小管間質(zhì)纖維化腎病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和發(fā)病機(jī)制。研究腎小管間質(zhì)纖維化過(guò)程中,腎小管上皮細(xì)胞是否發(fā)生表型轉(zhuǎn)化以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 的表達(dá)。

【注意事項(xiàng)】

1.病理組織學(xué)觀察要突出重點(diǎn)和動(dòng)態(tài)性觀察應(yīng)重點(diǎn)觀察腺嘌呤體內(nèi)氧化物 2.8—二羥基腺嘌呤以不溶性結(jié)晶的形式大量沉積于腎小管,從而使腎小管擴(kuò)張,變性壞死,間質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn),增生結(jié)節(jié)形成,腎間質(zhì)廣泛纖維化。應(yīng)抓住這一主線(xiàn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。

2.腺嘌呤給藥劑量和方法是造模成功的關(guān)鍵由于腺嘌呤水溶性極低,故傳統(tǒng)給藥方法多將腺嘌呤摻人固體飼料中隨機(jī)飼喂,但不同動(dòng)物的實(shí)際藥物攝入量差異較大,因此,個(gè)體間存在顯著的病變差異。本模型建立的過(guò)程中對(duì)給藥途徑進(jìn)行了改良,即將腺嘌呤加入2%的淀粉溶液中,加熱制成腺嘌呤淀粉混懸液給動(dòng)物灌胃。這樣可嚴(yán)格控制給藥劑量。

【模型評(píng)估】 TIF 臨床病程漫長(zhǎng),病因復(fù)雜,加上取材的局限性,對(duì)其病理過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究比較困難,因此典型而穩(wěn)定的動(dòng)物模型是研究 TIF 的重要手段。常見(jiàn) TIF 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒎椒òㄋ幬镎T導(dǎo)、免疫介導(dǎo)、腎次全切除、單側(cè)尿路阻塞、放射損傷等方法,但均有各種的弊端,難以獲得穩(wěn)定的結(jié)果。腺嘌呤 TIF 模型病變典型而穩(wěn)定,改進(jìn)了給藥方法,造模成功率近 100％,是研究 TIF 病理機(jī)制很好的動(dòng)物模型。

文章轉(zhuǎn)載于北京吉田生物科技有限公司