1.6 ?病料處理

采集病豬的小腸，剪碎后轉(zhuǎn)入研磨器中，加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，研磨成10%的組織懸液，反復(fù)凍融3次，3000r/min離心10min后取上清，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/span>

病豬的糞便用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液作10倍稀釋后加入雙抗（終濃度1000IU/ml青霉素、1000μg/ml鏈霉素）于4℃作用12h，離心取上清，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/span>

1.7 ?RT-PCR擴增PEDV M基因

1.7.1 ?RNA的提取

取100mg組織樣品用剪刀剪碎后，置于研磨器中，加入2ml的DMEM培養(yǎng)基，研磨至組織呈勻漿狀，置-70℃凍融2~3次后，5000 r/min離心10 min后，取上清200μl至1.5 ml離心管，每管加入1 ml RNA-Solv??Reagent RNA Isolation Solvent，顛倒混勻，室溫靜置5~10min。每管加入200 μl氯仿，渦旋15 sec，嚴(yán)格冰浴10 min，4℃ 12,000r/min離心10min。取80%的上清轉(zhuǎn)至新的1.5 ml離心管，加入500 μl異丙醇，混勻，室溫靜置10min，室溫12,000r/min離心10min。棄上清，每管加入1.2ml無水乙醇和300μl DEPC水，輕微渦旋，7500r/min離心5min，棄上清，用槍頭吸干殘留水份，風(fēng)干5~10min，最后加入20μl DEPC水溶解。紫外分光光度計測定A260及A280值，確定樣品RNA含量及純度，-70℃保存?zhèn)溆谩?/span>

1.7.2 ?反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

反轉(zhuǎn)錄體系按照表1加入。

表1 ?反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

10×RT Buffer

1.0 μl

dNTPs (10mM)

1.0 μl

MgCl2

2.0μl

RNase Inhibitor

0.25 μl

ReverTra Aceò

0.5 μl

Oligo(dT)20

1.0 μl

RNA模板

適量體積（0.2μg）

RNase Free H2O

加至終體積10.0 μl

反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序為：42.0℃反轉(zhuǎn)錄30min，95.0℃ 5min，進行反轉(zhuǎn)錄。獲得的cDNA用作PCR擴增的模板。

1.7.3 ?PCR擴增

根據(jù)GenBank 登錄的PEDV(No.JQ282909)基因組序列設(shè)計一對特異性引物，擴增PEDV M基因（表2），引物序列為：

上游引物P1：5’－TTCCCGTTGATGAGGTGAT－3’

下游引物P2：5’－AAGCATTGACTGAACGACC－3’

擴增片段大小為552bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表2 ?PCR反應(yīng)體系

10×Ex Buffer

2.5 μl

Ex Taq

0.125 μl

上游引物

0.75μl

下游引物

0.75μl

cDNA模板

5μl

dd H2O

加至終體積25.0 μl

反應(yīng)條件為：94℃變性5 min后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為：94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min；35個循環(huán)后72℃延伸10min。

取擴增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，觀察結(jié)果并拍照。

1.8 ?病毒分離

取經(jīng)RT-PCR檢測為PEDV陽性的病料懸液1ml接種已長成單層的Vero細(xì)胞（接種前倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗2次），并加入1ml的細(xì)胞維持液（含10μg/ml胰酶的無血清DMEM培養(yǎng)液），37℃吸附1h，吸棄接種物，補加5ml的細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察，如出現(xiàn)細(xì)胞病變即及時收毒，如無細(xì)胞病變出現(xiàn)，則在培養(yǎng)72h時收毒，并繼續(xù)盲傳，盲傳7代后仍無病變者棄去不要。

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