Cancer Cell | CD58（LFA-3）缺失通過促進(jìn)CMTM6上調(diào)PDL1抑制抗腫瘤免疫

這項(xiàng)研究還是聚焦在腫瘤免疫，分析在免疫檢查點(diǎn)治療中出現(xiàn)抵抗的原因及其機(jī)制。過往研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中往往會(huì)自主降低CD58的表達(dá)，而這常與ICB治療抵抗以及T細(xì)胞耗竭相關(guān)。但是機(jī)制并不清楚。

CD58，有一個(gè)另外的名字淋巴細(xì)胞粘附因子3（LFA-3），主要表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞上，能夠與T細(xì)胞CD2結(jié)合，而作為第二信號(hào)激活T細(xì)胞。會(huì)進(jìn)一步作為粘附分子促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞的結(jié)合。

這項(xiàng)研究在前人信息的基礎(chǔ)上，首先通過單細(xì)胞測(cè)序篩選了并進(jìn)一步確認(rèn)了CD58的缺陷與腫瘤免疫逃逸和ICB治療抵抗相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CD58的缺失會(huì)一直與T細(xì)胞CD2的鏈接，減少T細(xì)胞的激活、抑制腫瘤T細(xì)胞浸潤(rùn)以及細(xì)胞增殖，同時(shí)增加PDL1蛋白來促進(jìn)免疫逃逸。

為了進(jìn)一步明確相關(guān)機(jī)制，作者通過CRISPR-Cas9以及蛋白質(zhì)組學(xué)篩選，確認(rèn)了CMTM6對(duì)于CD58缺失介導(dǎo)的PDL1上調(diào)至關(guān)重要。CD58和PDL1對(duì)于CMTM6結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)確定了他們主要通過內(nèi)體循環(huán)還是通過溶酶體講解來決定。

總的來說，這項(xiàng)研究明確了CD58缺失通過CMTM6促進(jìn)PDL1上調(diào)而抑制抗腫瘤免疫。

▉結(jié)果：

1.腫瘤細(xì)胞CD58的表達(dá)是抗腫瘤免疫免疫的基礎(chǔ)

CD58下調(diào)或丟失與癌癥免疫逃逸和黑色素瘤ICB治療抵抗相關(guān)；然而，對(duì)其基本機(jī)制了解不多。利用scRNA-seq對(duì)黑色素瘤患者進(jìn)行了匹配的ICB治療前和治療早期的腫瘤活檢，以及臨床反應(yīng)數(shù)據(jù)（圖1A）。發(fā)現(xiàn)，與無應(yīng)答者（NR）相比，應(yīng)答者（R）在基線和治療過程中CD58上調(diào)特征的表達(dá)都更高（圖1B）。因此，患者的數(shù)據(jù)表明，癌細(xì)胞內(nèi)在的CD58的表達(dá)與有效的抗腫瘤免疫有關(guān)。

為了從機(jī)制上剖析CD58癌細(xì)胞表達(dá)在T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤裂解中的作用，我們使用了由黑色素瘤細(xì)胞和自體體外擴(kuò)增的TILs組成的患者源性聯(lián)合培養(yǎng)物。用CD58基因敲除（KO），然后用CD58-TM或CD58-GPI開放閱讀框（ORFs）的過表達(dá)（OE）進(jìn)行拯救，然后進(jìn)行TIL共培養(yǎng)，產(chǎn)生了其他同源的細(xì)胞系。CD58的缺失導(dǎo)致腫瘤裂解和T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-?明顯減少，而用CD58-TM或CD58-GPI的拯救使癌細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷重新敏感，并逆轉(zhuǎn)了IFN-?的產(chǎn)生（圖1C、1D）。

為了排除CD58缺失通過非特異性效應(yīng)賦予免疫規(guī)避的可能性，設(shè)計(jì)了人類外周血單核細(xì)胞（PBMCs）來表達(dá)一種T細(xì)胞受體（TCR），該受體對(duì)常見的癌癥睪丸抗原NY-ESO-121具有高親和力，它經(jīng)常在HLA-A?2：01等位基因的黑色素瘤中表達(dá)和呈現(xiàn)，包括在的一個(gè)細(xì)胞系模型2686。在這個(gè)工程化的聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)中，2686細(xì)胞中CD58或B2M（這是MHC I類抗原呈遞所必需的）的缺失賦予了對(duì)NY-ESO-1-TCR T細(xì)胞的抵抗力，從而證實(shí)了CD58表型是由特定TCR/表位相互作用介導(dǎo)的。這些結(jié)果共同表明，癌細(xì)胞表達(dá)的CD58通過以TCR特異性/表位素依賴性的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性TIL活性來決定腫瘤敏感性。

2.腫瘤細(xì)胞CD58的表達(dá)以依賴CD2的形式促進(jìn)了T細(xì)胞反應(yīng)

那么癌細(xì)胞自主的CD58表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)是否是通過與T細(xì)胞上表達(dá)的CD2相互作用而發(fā)生的。

雖然CD58-TM或CD58-GPI的重新表達(dá)逆轉(zhuǎn)了CD58 KO細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞共培養(yǎng)的敏感性，但加入CD2-或CD58阻斷抗體（但不包括IgG對(duì)照）會(huì)廢除這種重新敏感化。用CD58WT-TM、CD58WT-GPI、CD58K34A-TM或CD58K34A-GPI ORFs拯救CD58 KO細(xì)胞，然后與自體TILs或NY-ESO-1-TCR T細(xì)胞共同培養(yǎng)。雖然WT CD58構(gòu)建體的過表達(dá)挽救了對(duì)TILs殺傷的敏感性和IFN-?的產(chǎn)生，但CD58K34A-TM或CD58K34A-GPI ORFs卻沒有（圖1E）。接下來用CRISPR-Cas9敲除TILs上的CD2，并將WT或CD2 KO TILs與親代或CD58-TM OE癌細(xì)胞共同培養(yǎng)。與WT TILs相比，CD2 KO TILs對(duì)親本或CD58-TM OE細(xì)胞表現(xiàn)出最小的細(xì)胞毒性（圖1F）。

接下來，考慮是否可以通過CD2刺激TILs以增強(qiáng)其細(xì)胞毒性活性。使用了重組的CD58-Fc嵌合體同源物，與CD3刺激相結(jié)合，足以增加TIL的增殖和體外IL-2的產(chǎn)生，而且明顯高于單獨(dú)的CD3刺激或與CD28刺激相結(jié)合。值得注意的是，接受CD58-Fc嵌合體共同刺激的細(xì)胞（與僅通過CD3激活的TILs相比）更有效地殺死親代癌細(xì)胞（以及CD58 KO細(xì)胞，但程度較低，可能是由于旁觀者的細(xì)胞因子活動(dòng)）（圖1G）。發(fā)現(xiàn)在多個(gè)黑色素瘤細(xì)胞系上沒有CD48的表達(dá)，它是一種替代的CD2配體；因此，CD48不太可能在這種情況下發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果表明，完整的CD58-CD2軸對(duì)于TIL介導(dǎo)的癌細(xì)胞的有效裂解是必要的，而這種特定配體-受體相互作用的破壞會(huì)使癌癥免疫逃避。

3.CD58的缺失通過抑制腫瘤內(nèi)T細(xì)胞浸潤(rùn)和增殖而抑制抗腫瘤免疫

有效的抗腫瘤免疫和對(duì)ICB的反應(yīng)的一個(gè)主要障礙是CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)很差或完全沒有。因此試圖研究CD58的丟失是否也能損害體內(nèi)T細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)。

因?yàn)闆]有已知的CD58的小鼠同源物，用NOG小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac）建立了一個(gè)部分人源化的小鼠模型，轉(zhuǎn)基因表達(dá)人白細(xì)胞介素-2（hIL2）。在這些動(dòng)物中，將CD58 WT患者來源的黑色素瘤細(xì)胞與CD58 KO或CD58-TM OE細(xì)胞一起皮下植入雙側(cè)腹腔腫瘤，然后用自體TILs（或PBS對(duì)照）進(jìn)行收養(yǎng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)移（ACT）（圖2A）。CD58 KO腫瘤對(duì)ACT高度耐受（8只動(dòng)物中沒有反應(yīng)者），而一半的CD58 WT腫瘤對(duì)ACT表現(xiàn)出完全或部分反應(yīng)（圖2B和2C），這表明CD58的喪失在體內(nèi)驅(qū)動(dòng)免疫逃避。有趣的是，未經(jīng)治療的CD58 KO腫瘤比其WT腫瘤生長(zhǎng)得更快，這一點(diǎn)以前在體外沒有觀察到，這表明CD58缺失可能在體內(nèi)加速腫瘤生長(zhǎng)的額外影響。

通過流式細(xì)胞儀分析腫瘤的T細(xì)胞浸潤(rùn)，發(fā)現(xiàn)與CD58 WT腫瘤相比，CD58 KO腫瘤的CD8+TILs浸潤(rùn)低了100倍，這與組織切片的多重免疫熒光（IF）相一致（圖2D和2E）。此外，在腫瘤浸潤(rùn)的T細(xì)胞中，來自CD58 KO腫瘤的T細(xì)胞與來自CD58 WT腫瘤的T細(xì)胞相比，增殖率明顯降低（圖2F）。相反，在CD58-TM OE腫瘤中，T細(xì)胞的浸潤(rùn)和隨后的增殖都得到了逆轉(zhuǎn)。

為了進(jìn)一步剖析T細(xì)胞浸潤(rùn)的動(dòng)力學(xué)，在ACT后不久（7天）確定了腫瘤攜帶者（CD58 WT或KO）動(dòng)物的T細(xì)胞豐度。發(fā)現(xiàn)在這個(gè)早期時(shí)間點(diǎn)，CD58 KO腫瘤中的總CD8+和顆粒酶B+CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)都有所減少。同樣，用CD58阻斷抗體治療的腫瘤動(dòng)物的T細(xì)胞浸潤(rùn)和分化也減少了。這些結(jié)果共同表明，癌細(xì)胞內(nèi)在的CD58表達(dá)對(duì)T細(xì)胞早期進(jìn)入腫瘤和瘤內(nèi)分化至關(guān)重要，與ICB抗性黑色素瘤患者的預(yù)測(cè)一致。

4.CD58的缺失促進(jìn)了PDL1的上調(diào)抑制了抗腫瘤免疫

CD58的缺失足以促進(jìn)PD-L1的同時(shí)上調(diào)，但這種共同調(diào)節(jié)的基本機(jī)制和功能作用仍然未知。

為了解決這個(gè)問題，首先使用CD58 KO細(xì)胞系，用CD58-TM或CD58-GPI進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，然后進(jìn)行IFN-?刺激和PD-L1的流式細(xì)胞儀或總蛋白評(píng)估。雖然CD58缺失導(dǎo)致PD-L1表面和總蛋白豐度增加，但用任何一種CD58異構(gòu)體救治都會(huì)廢除同時(shí)出現(xiàn)的PD-L1增加，甚至將PD-L1抑制到基線水平以下（圖3A-3C）。用K34A突變的CD58 ORFs拯救的CD58 KO細(xì)胞也能下調(diào)PD-L1的表達(dá)，這表明這個(gè)CD2結(jié)合位點(diǎn)對(duì)CD58/PD-L1的共同調(diào)控不是必需的。重要的是，MHC I蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)在CD58無效細(xì)胞和CD58任一異構(gòu)體的拯救中都保持不變（圖3D），表明對(duì)TIL共培養(yǎng)的抵抗和拯救的敏感性都不是由于抗原呈現(xiàn)的改變。

為了確定PD-L1的增加是否有助于CD58損失中的癌癥免疫逃避，接下來進(jìn)行了CD58 KO癌細(xì)胞與或不與藥物PD-L1阻斷的共同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。為此，在體外用抗CD3抗體刺激CD8+自體TILs，產(chǎn)生PD-1+TILs。當(dāng)與PD-1+TILs在抗PD-L1阻斷抗體存在下共同培養(yǎng)時(shí)，CD58 KO黑色素瘤細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)TIL介導(dǎo)的殺傷的敏感性增加，而對(duì)照細(xì)胞仍不受影響（圖3E）。因此，CD58缺失時(shí)PD-L1表達(dá)升高有助于免疫規(guī)避，增加了CD58缺失或下調(diào)可能導(dǎo)致ICB抵抗的機(jī)制。

5.基因組規(guī)模的CRISPR-Cas9篩選確定CMTM6為CD58的正向調(diào)節(jié)器

為了開始剖析CD58/PD-L1共調(diào)控的機(jī)制，首先尋求確定CD58的調(diào)節(jié)器。首先，進(jìn)行了全基因組CRISPR-Cas9功能缺失篩選，結(jié)合熒光激活細(xì)胞分選（FACS）（圖4A）。與對(duì)照組中表達(dá)CD58的細(xì)胞（CD58mi）相比，有11個(gè)基因靶點(diǎn)在CD58lo細(xì)胞內(nèi)被持續(xù)富集（圖4B、4C）。正如預(yù)期的那樣，這個(gè)篩選中最重要的 "命中 "是敲除CD58本身；其他預(yù)期的命中包括PIGV和PGAP2，它們都參與GPI錨的形成，進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)篩選的穩(wěn)健性。有趣的是，名列前茅的是CMTM6，它最近被描述為PD-L1維護(hù)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)器。

6.CMTM6通過內(nèi)體循環(huán)與CD58結(jié)合并促進(jìn)其蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

值得注意的是，在CRISPR-Cas9或IP-MS篩選中，沒有發(fā)現(xiàn)CD58和PD-L1之間有直接的遺傳或蛋白質(zhì)相互作用，這表明它們的共同調(diào)節(jié)是由另一個(gè)媒介控制的。由于CMTM6被提名為跨屏幕的CD58的調(diào)節(jié)器，并考慮到其參與PD-L1表面蛋白的維護(hù)，選擇進(jìn)一步研究其作為這樣一個(gè)潛在調(diào)節(jié)器的作用。

首先，驗(yàn)證了CMTM6在用于IP-MS的蛋白裂解液中與CD58共同免疫沉淀（圖5B）。其次，產(chǎn)生了CMTM6 KO黑色素瘤細(xì)胞系，并顯示CMTM6的缺失導(dǎo)致多個(gè)模型中CD58和PD-L1表面和總蛋白豐度與其他同源對(duì)照相比下降（圖5C-5E）。用CMTM6 ORF拯救CMTM6 KO足以恢復(fù)蛋白CD58和PD-L1的表達(dá)。相反，CD58的mRNA水平不受CMTM6擾動(dòng)的影響，表明CMTM6在蛋白水平而不是轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)CD58（圖5F）。

鑒于CMTM6在穿梭PD-L1到回收內(nèi)體中的作用，接下來調(diào)查了CD58和CMTM6的亞細(xì)胞定位。在中頻共聚焦成像中，CD58與CMTM6在回收內(nèi)體（以轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）的表達(dá)為標(biāo)志）和細(xì)胞膜上都有共聚焦（圖5G）。此外，已知CMTM6將PD-L1運(yùn)送到循環(huán)內(nèi)體，以防止其在溶酶體中降解，因此推斷CMTM6可能會(huì)類似地調(diào)節(jié)CD58。事實(shí)上，在基于流式細(xì)胞儀的降解試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)CD58和PD-L1，但不是MHC I類，在CMTM6 KO中的降解率比同源親代細(xì)胞高，而且這種降解可以被溶酶體抑制劑所限制（圖5H）。接下來，使用黑色素瘤異種移植和患者腫瘤（原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤病變）的接近結(jié)扎試驗(yàn)（PLA），明CMTM6和CD58在原位保持密切的物理接近（圖5I-5K）。因此與穩(wěn)定PD-L1相似，CMTM6與CD58結(jié)合并促進(jìn)其從細(xì)胞表面回收到內(nèi)體，從而防止其溶酶體降解。與這一發(fā)現(xiàn)相一致的是，我們?cè)贑RISPR-Cas9 KO篩選中發(fā)現(xiàn)的CD58的另一個(gè)正向調(diào)節(jié)因子是DNAJC13，其編碼的蛋白在介導(dǎo)膜從早期內(nèi)體到回收內(nèi)體的販運(yùn)中起作用。

隨之作者證實(shí)了CMTM6對(duì)于在CD58缺失中促進(jìn)PDL1的表達(dá)中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步證實(shí)了CMTM6介導(dǎo)的細(xì)胞外循環(huán)對(duì)于CD58或者PDL1的結(jié)合是十分重要的。

Refrence：

1.The CD58-CD2 axis is co-regulated with PD-L1 via CMTM6 and shapes anti-tumor immunity

小編：阿羽

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