前言

2022年2月，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所鮑大鵬研究員課題組在《Frontiers in Microbiology》期刊發(fā)表的題為“Oxidative Stress and Autophagy Are Important Processes in Post Ripeness and Brown Film Formation in Mycelium of Lentinula edodes”的研究成果，通過iTRAQ標(biāo)記定量蛋白組學(xué)、GC-MS非靶向代謝組學(xué)等技術(shù)對香菇菌絲進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激和自噬是香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色重要過程，并對其在蛋白質(zhì)組和代謝組水平上的分子機(jī)制有了新的認(rèn)識。

中文標(biāo)題：氧化應(yīng)激和自噬是香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色形成的重要過程

發(fā)表期刊：Frontiers in Microbiology

影響因子：5.64

作者單位：上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所

涉及的歐易/鹿明生物服務(wù)產(chǎn)品：iTRAQ標(biāo)記定量蛋白組學(xué)、GC-MS非靶向代謝組學(xué)

研究背景

香菇一直被用于烹飪和醫(yī)藥，它們含有許多營養(yǎng)和生物活性化合物，比如香菇多糖是一種重要的抗腫瘤藥物。香菇培育周期長，包括四個不同的階段：營養(yǎng)菌絲生長、菌絲后后熟轉(zhuǎn)色(BF)形成、原基和子實(shí)體的發(fā)育。其中菌絲后熟轉(zhuǎn)色形成至少需要2個月，是原基發(fā)生前的重要階段，其也影響香菇的產(chǎn)量和品質(zhì)的重要階段。但是香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色的遺傳機(jī)制研究比較少，本研究在組學(xué)水平上對香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色的生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)分析。

研究思路

實(shí)驗(yàn)方法

(1)研究材料：菌包表層菌絲生長后30、45、60和75天取材

(2)蛋白組學(xué)測定：iTRAQ標(biāo)記定量蛋白組學(xué)

(3)基于液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法的肽分離和定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

(4)差異表達(dá)蛋白的基因本體論注釋與生物信息學(xué)分析

(5)Westernblot和定量PCR驗(yàn)證iTRAQ蛋白組數(shù)據(jù)

(6)代謝物提取和氣相色譜-質(zhì)譜法：GC-MS非靶向代謝組學(xué)

(7)透射電鏡術(shù)

研究結(jié)果

棕色薄膜形成

通過在4個不同時間（菌絲生長后30、45、60和75天）檢測后熟和BF形成過程中的形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)菌絲體逐漸發(fā)展為BF，并伴隨著從第45天到75天的L?（亮度）值逐漸下降(圖1A)。如圖1B所示，菌絲在無光照的30天內(nèi)呈白色，并開始菌絲后熟和BF形成階段。大部分菌絲在第60天形成BF，在光照射下在第75天完成轉(zhuǎn)色基本完成。

圖1 | 光照下（12h暗/12h光照下75天）香菇表面菌絲L*值（平均±SE，n=5）的變化及菌絲發(fā)育時棕色膜形成的表征

褐膜形成過程中菌絲體的蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)模式

為了研究蛋白質(zhì)組變化的時間過程，作者測定了4個不同時間內(nèi)上調(diào)和下調(diào)蛋白的數(shù)量。采用基于iTRAQ標(biāo)記定量蛋白組學(xué)方法來獲得與后熟后和BF形成相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)變化的總體視圖。在這四個階段的樣品中，總共產(chǎn)生了150,867個質(zhì)譜。積累增加的閾值倍數(shù)變化截止值為2.0倍，如Venn圖(圖2B)所示，三組（2-1、3-1和4-1）中共有75個DEPs。組2-1和3-1組共享98個DEPs，組2-1和4-1組共享92個，組3-1和4-1組共享94個。兩個樣本中不同蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性相對較好（補(bǔ)充圖2）。因此，當(dāng)有BF的樣品（45、60和75天）與沒有BF的樣品（30天）進(jìn)行比較時，有許多DEPs，并且一些關(guān)鍵的DEPs是共同的。

圖2 | 參與香菇褐膜形成的差異表達(dá)蛋白(DEPs)

差異表達(dá)蛋白的功能注釋和分類

將三個實(shí)驗(yàn)組的DEPs合并，利用生物信息學(xué)進(jìn)行分析，確定相關(guān)通路。在生物過程(BP)中，注釋了188個蛋白，153個GO術(shù)語富集。在類別細(xì)胞成分(CC)中，192個蛋白質(zhì)被注釋，27個GO術(shù)語被富集。在分子功能類別(MF)中，注釋了191個蛋白，并富集了139個GO術(shù)語。圖3A顯示了每個類別中前10個顯著豐富的術(shù)語（在第6級）。在BP中，腎臟代謝過程是最具代表性的術(shù)語(P=8e-04)，其次是一系列代謝過程和對ROS的年齡依賴性反應(yīng)、液泡遺傳、脂質(zhì)氧化、饑餓反應(yīng)的固定相維持、核-液泡連接組裝、過氧化物酶體裂變和線粒體裂變。因此，一些主要的BP術(shù)語與氧化應(yīng)激反應(yīng)和自噬有關(guān)。

在CC中，15.9%的DEPs屬于線粒體類別(P=0.0389)。在MF中，氧化石墨烯的催化活性占主導(dǎo)地位。在KEGG分析中，大多數(shù)代謝途徑顯著富集，包括長壽調(diào)節(jié)途徑-多個物種(圖3B）。如圖3C所示，線粒體裂變、膜裂變和對ROS的年齡依賴性反應(yīng)也顯著富集。KEGG分析顯示，長壽調(diào)節(jié)途徑-多物種也是最具代表性的途徑(P=3.38e-03；圖3D)。這些結(jié)果表明，線粒體形態(tài)、衰老和ROS的變化在BF形成的生理過程中起著重要作用。

圖3 | 對(A，B)香菇褐膜形成過程中75個差異表達(dá)蛋白的239個和(C，D)75個差異表達(dá)蛋白(DEPs)的生物信息學(xué)分析

Westernblot和定量PCR驗(yàn)證iTRAQ蛋白組數(shù)據(jù)

為了驗(yàn)證iTRAQ標(biāo)記蛋白組學(xué)分析測定的蛋白積累變化，選擇兩種蛋白進(jìn)行westernblot分析。如圖4A所示，iTRAQ分析中兩種蛋白(RPD3和VMA3)的積累每次均與westernblot數(shù)據(jù)一致。RPD3、TOR1、VMA3和VAC8在基因水平上的相對表達(dá)量與蛋白水平相似，在BF的菌絲中也表達(dá)上調(diào)(圖4B-D)。VAC8在2－1、3－1、4－1組的基因水平上高度上調(diào)。這些結(jié)果表明，這些上調(diào)的表達(dá)蛋白可能是香菇BF形成的重要蛋白。

圖4| iTRAQ蛋白質(zhì)組鑒定蛋白在香菇褐膜形成過程中的積累模式的驗(yàn)證

轉(zhuǎn)色過程的代謝組學(xué)

為了三個對照組間聚類的總體概述，作者對GC-MS全譜代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。在PCA評分圖(圖5B)中，主要模型參數(shù)為三個主成分，R2X=0.539和Q2=0.414。r2X值表明該模型可靠，適用于解釋三組間的代謝差異。4個樣品之間明顯分離，表明在成熟后和BF形成過程中存在代謝差異。此外，在PLS-DA(R2X=0.924，R2Y=0.881和Q2=0.771)中，來自不同時間的4個樣本也被分離(圖5C)，強(qiáng)烈表明了代謝的變化樣品之間的過程。因此，氣相色譜-質(zhì)譜可以檢測到的代謝物有很大的差異。

圖5 | 香菇棕色膜形成過程中代謝物顯著變化維恩圖及BF形成過程中代謝譜主成分分析和偏最小二乘判別分析評分圖

轉(zhuǎn)色過程中代謝的時間依賴性

為了進(jìn)一步確定BF形成過程中各代謝物的時間依賴性模式，作者發(fā)現(xiàn)甘露醇和海藻糖含量最高在30天，酪氨酸含量最高45天，麥芽糖和葡萄糖含量最高60天，二甘油含量最高75天，具有相似反應(yīng)模式的代謝物聚集在一個樹的兩個主要類群中。第1組包括甘露醇、海藻糖、異亮氨酸、亮氨酸、l-蘋果酸、o-琥珀?；呓z氨酸、琥珀酸、苯丙氨酸、纈氨酸、4-氨基丁酸、6-磷酸葡萄糖酸、脯氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和馬來酰亞胺。組1的代謝物在30天時含量豐富，但隨后從45天下降到75天。組2主要包括雙甘油、氧脯氨酸、-甘露基甘油、D-（甘油1-磷酸）、瓜氨酸、谷氨酸、肌醇、谷氨酰胺、D-谷糖和葡萄糖。與30天的水平相比，第2組代謝物的水平從45天到75天顯著升高。此外，第2組代謝物酪氨酸、鳥氨酸、磷酸鹽和麥芽糖的水平在第45天開始升高，然后在第75天顯著下降。雙甘油從60天增加到75天，明顯是第2組代謝物。因此，這些代謝物可作為香菇BF形成的潛在生物標(biāo)志物。

圖6 | 香菇BF形成的潛在生物標(biāo)志物

菌絲成熟和棕色膜形成過程中的活性氧和自噬

蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析數(shù)據(jù)表明，ROS和自噬在成熟后和BF形成過程中被激活。ROS檢測顯示過氧化氫水平逐漸升高。隨著BF的形成，在第60天達(dá)到最高水平。此外，在透射電鏡中觀察到自噬體樣結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核、液泡、高爾基體、線粒體和細(xì)胞壁都很容易區(qū)分(圖7A-D)，在45、60和75天觀察到自噬的特征特征?？张莼l(fā)生迅速，在第60天，空泡數(shù)量增加(圖7C)。細(xì)胞膜從細(xì)胞壁收縮，出現(xiàn)膜泡（圖7B-D）。在第75天，在一個較大的液泡中觀察到一個含有可循環(huán)成分的自噬小體(AP)(圖7d)。此外，每個細(xì)胞中空泡和自噬體的平均數(shù)量在60天時最高。因此，在可能由ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞中，可以明顯地觀察到自噬的特征。

圖7 | 無棕色膜及培養(yǎng)物超薄切片的透射電鏡圖像

研究結(jié)論

本研究以香菇菌絲為模型系統(tǒng)，采用蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和透射電鏡來表征香菇菌絲BF形成過程中ROS積累和自噬的變化。本研究的數(shù)據(jù)表明，自噬是香菇菌絲發(fā)育過程中的一個重要過程?；谶@些發(fā)現(xiàn)，作者提出了一個構(gòu)成香菇菌絲發(fā)育和自噬的潛在細(xì)胞事件的級聯(lián)反應(yīng)。饑餓和衰老作為誘導(dǎo)香菇菌絲細(xì)胞氧化應(yīng)激的信號，導(dǎo)致線粒體分裂、膜裂變、過氧化物酶體裂變和脂質(zhì)氧化。ROS猝滅物質(zhì)的減少，包括甘露醇和海藻糖，以及ROS刺激物質(zhì)，包括肌醇和葡萄糖的增加，會觸發(fā)ROS爆發(fā)，并促進(jìn)4-氨基丁酸的自噬。同時，氨基酸代謝也促進(jìn)了mTOR誘導(dǎo)的自噬（核-液泡連接和調(diào)節(jié)線粒體自噬）。在這一過程中，去乙?；窻PD3也可能參與其中，并最終通過自噬促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的再循環(huán)、色素沉著和原基的起始。因此，本研究提高了對香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色形成和子實(shí)體啟動的自噬依賴機(jī)制的認(rèn)識，同時也強(qiáng)調(diào)了自噬在香菇發(fā)育中的重要作用。

小鹿推薦

本研究利用標(biāo)記定量(iTRAQ)蛋白質(zhì)組學(xué)、基于氣相色譜-質(zhì)譜的代謝組學(xué)GC-MS非靶向代謝組學(xué)和透射電鏡分析細(xì)胞結(jié)構(gòu)，研究了香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色形成的機(jī)制，并且首次證明氧化應(yīng)激和自噬過程是至關(guān)重要，為后續(xù)進(jìn)一步的研究提供了新的見解。

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