2021年9月，臺北輔仁大學陸嘉真團隊在Gut發(fā)表的題為的研究成果，本研究通過小鼠吸煙（CS）的慢性阻塞性肺疾?。–OPD）模型構建，評估腸道微生物群在COPD發(fā)展中的因果關系，另外采用單細胞RNA測序、血清代謝組學以及16S?rRNA測序分析發(fā)現(xiàn)，腸道菌群組成顯著影響CS誘導的COPD發(fā)育，存在腸道菌群-肺COPD軸。金氏擬桿菌（）能改善COPD，降低腸道炎癥，增強結腸線粒體和核糖體活性，系統(tǒng)地恢復血清中異常宿主氨基酸代謝，以及抑制肺部炎癥。

中文標題：腸道微生物群調(diào)節(jié)慢性阻塞性肺病發(fā)病機制：抗炎性金氏擬桿菌脂多糖的作用

研究對象：慢阻肺病人、金氏擬桿菌

發(fā)表期刊：GUT

影響因子：23.059

發(fā)表時間：2021年9月28日

合作單位：臺灣輔仁大學

運用生物技術：非靶代謝組學、單細胞RNA測序、16S rRNA測序

研究背景

慢性阻塞性肺?。–OPD）是一種全球性的疾病，其特點是肺部氣流的慢性阻塞干擾了正常呼吸。盡管有報道發(fā)現(xiàn)呼吸道的微生物群與慢性阻塞性肺病有關，但腸道微生物群在慢性阻塞性肺病發(fā)展中的因果關系還沒有確定。因此作者研究了腸道微生物群組成和肺部COPD發(fā)展之間的聯(lián)系，并描述細菌及其衍生的活性成分對COPD的改善情況。

研究思路

研究方法

1、實驗樣本：小鼠（6-8周齡）

2、實驗分組：CTL（對照組），CS（吸煙模型組），ABX（抗生素處理組），NEO（新霉素處理組），AMP（氨芐青霉素處理組），WAN（萬古霉素），CS+Pg（金氏擬桿菌處理組）

研究結果

腸道微生物群參與COPD發(fā)展的證據(jù)

作者使用了小鼠的CS模型來研究腸道微生物群是否可能有助于CS誘發(fā)COPD的發(fā)展。研究結果表明，吸煙12周的CS小鼠體重明顯下降，支氣管肺泡灌洗液（BALF）中免疫細胞的浸潤增加；相比之下，與與對照組共同飼養(yǎng)的CS小鼠（CO-CTL）體重增加，浸潤的免疫細胞減少；對照組小鼠與CS（CO-CS）組出現(xiàn)了異常的表型。同時，肺組織切片的組織學分析顯示，與CTL小鼠相比，CS暴露的小鼠表現(xiàn)出周邊肺氣腫的變化，其特征是肺泡壁的破壞和氣隙的擴大。相比之下，CO-CTL組恢復了病理變化，而CO-CS組則加劇了病理變化。根據(jù)聯(lián)合研究的結果推測，CTL和CS小鼠的腸道細菌可能分別存在有益和不利的關系。

ABX治療可減少CS誘導的COPD發(fā)病

為了確定腸道微生物群組成在COPD發(fā)展中的重要性，在CS前2周對小鼠口服單個藥物（萬古霉素（VAN）、新霉素（NEO）、甲硝唑（MET）和氨芐青霉素（AMP））和組合藥物ABX17。在CS小鼠中觀察到的異常表型在ABX、AMP和VAN-治療組中得到明顯改善（圖1A-K）。相反，口服NEO或MET治療對COPD的發(fā)病機制影響不明顯（圖1A-K）。結果表明，共生微生物群的組成影響CS誘導的COPD的炎癥和發(fā)病機制，ABX是治療COPD小鼠肺部的最佳方式。

圖1 | 建立腸道微生物群與COPD發(fā)展的關系

腸道微生物群組成對COPD的發(fā)展起著因果作用

ABX治療的有益作用可能是通過改變腸道微生物群組成來介導的。為了了解腸道微生物群結構的改變是否會對COPD的發(fā)展起到因果作用，作者進行了糞便微生物群移植（FMT）實驗。將經(jīng)ABX、NEO、AMP或VAN處理的CTL或CS小鼠的供體糞便微生物群轉移到CS受體小鼠身上。來自CTL、ABX處理、AMP處理或VAN處理小鼠的糞便微生物群明顯改善了COPD綜合癥（圖1L-U）。相反，來自CS或NEO-處理的小鼠的微生物群未能逆轉CS受體的COPD特征（圖1L-U）。因此，腸道微生物群結構的改變可能對COPD的發(fā)病機制起到因果作用。

使用16S rDNA測序確定了各組小鼠的腸道微生物群組成（圖2A）。與CTL小鼠相比，CS小鼠糞便中和的相對豐度明顯降低，的相對豐度則增加。ABX治療和FMT都會影響CS小鼠的腸道微生物群組成（圖2A）。

通過使用宏基因組測序（圖2B），確定了與CS組相比因抗生素（ABX、NEO、AMP和VAN）而明顯改變的17種細菌物種。其中金氏擬桿菌和大腸桿菌與COPD嚴重程度明顯負相關（圖2C），16S測序數(shù)據(jù)中 (Pg)和大腸桿菌的相對豐度與qPCR驗證的數(shù)據(jù)基本一致，然而AMP組中Pg的相對豐度在qPCR數(shù)據(jù)中沒有明顯改變。此外，任何兩組之間通過FMT明顯改變的細菌種類表明，只有Pg在ABX、VAN和AMP處理的小鼠組有增加的趨勢（圖2D）。

在CS小鼠中發(fā)現(xiàn)明顯增加，推測COPD嚴重程度和之間的呈現(xiàn)正相關性。因此，結合所有獲得的數(shù)據(jù)，選擇Pg進行后續(xù)研究。

圖2 | 不同小鼠組的金氏副桿菌與COPD嚴重程度呈負相關

Pg MTS01改善COPD

隨后作者從ABX處理的糞便微生物群樣本中分離出一株Pg菌株MTS01。Pg MTS01的16S rRNA基因測序顯示與Pg JCM13446的基因有99.9%的一致性?？诜g MTS01的小鼠體重明顯增加并改善COPD表型（圖3A-J）。在結腸中，Pg MTS01治療減少了促炎癥細胞因子如IL-1β和TNF-α的表達，并增加了CS小鼠ZO-1和Occludin的表達。Pg MTS01進一步恢復了在Caco-2-細胞體外模型中TNF-α誘導的細胞層通透性。分析Pg MTS01對體重變化、肺部和肝臟的組織病理學、血清GPT和BUN水平的影響，結果表明Pg MTS01對健康小鼠沒有不良影響。

圖3 | Pg MTS01可改善COPD

Pg MTS01降低CS小鼠腸道炎癥，增強細胞核糖體和線粒體活性

為了進一步確定Pg MTS01對結腸細胞生理學影響，作者對經(jīng)過或未經(jīng)過Pg MTS01處理的CS小鼠的結腸組織衍生細胞進行了單細胞RNA測序（scRNAseq）和分析（圖4A、B）。與CTL小鼠相比，CS小鼠的脂肪酸代謝、二十烷烴代謝、膜微血管形成和內(nèi)肽酶活性的基因表達增加，而涉及核糖體生物生成和線粒體活性的基因表達減少。

相比之下，Pg MTS01給藥后，CS小鼠的細胞抗氧化劑、氧化還原過程、抗菌劑、線粒體去極化、核糖體活性和粘蛋白產(chǎn)生等基因明顯上調(diào)（圖4C、D）。Mptx1、Ang4和Muc2、RNR1、RNR2、Cytb、PgC-1α、ND-5和線粒體編碼的轉錄因子A基因的表達水平與氧化應激和核糖體或線粒體活動有關，結果通過qPCR進一步驗證。

相比之下，Pg MTS01對CS小鼠的任何GO途徑都沒有明顯的下調(diào)。隨后作者分別測量了與氧化磷酸化和非線粒體糖酵解功能有關的耗氧率（OCR）和細胞外酸化率（ECAR），結果證明Pg MTS01增加了CS小鼠的異常OCR活動，并降低了ECAR。因此，推測Pg MTS01有減少炎癥的功能，并可以恢復CS小鼠結腸中被廢除的細胞核糖體和線粒體活性。

圖4 | 單細胞RNA測序結果

Pg MTS01系統(tǒng)性恢復Cs小鼠異常氨基酸代謝

口服Pg MTS01改善COPD肺部發(fā)病機制的現(xiàn)象可能與恢復血液中的系統(tǒng)異常代謝有關。為了進一步確定小鼠血清中的代謝組學是否受到Pg MTS01治療的影響，作者進行了非靶代謝分析。對血清代謝物的代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)Pg MTS01治療最明顯地改善了CS小鼠的異常氨基酸相關代謝途徑，包括增加瓜氨酸和脯氨酸的生物合成，苯丙氨酸和甘氨酸的降解等。因此，推測Pg MTS01可能增強與細胞核糖體、線粒體活動以及尿素循環(huán)周轉有關的氨基酸代謝。

Pg MTS01減少Cs小鼠的肺部炎癥

進一步的肺組織單細胞RNA測序分析表明，CS增加了B細胞和巨噬細胞的存活數(shù)，并減少了T細胞和中性粒細胞的數(shù)量，而這些改變都能被Pg MTS01的給藥所逆轉（圖4E，F(xiàn)）。此外，Pg MTS01明顯恢復了CS小鼠中發(fā)現(xiàn)的異?；虮磉_模式。相比之下，涉及抗氧化活性、二十烷烴結合活性、脂肪酸合成和免疫反應的基因被上調(diào)（圖4G-I）。然而，Pg MTS01沒有明顯降低CS小鼠的血清IgG水平。簡而言之，Pg MTS01減少了過度炎癥免疫反應，包括那些與肺組織中B細胞受體信號有關的反應。

Pg MTS01 LPS（Pg LPS）拮抗大腸桿菌LPS誘導的炎癥

對Pg MTS01的全基因組序列進行BLAST分析（圖5C），發(fā)現(xiàn)參與脂質(zhì)A合成的基因與和中的基因相似（圖5D，E）。相對于腸道細菌分離出的促炎性脂多糖（LPS），Bacteroides衍生的LPS亞型表現(xiàn)出明顯較低的內(nèi)毒素和免疫刺激反應。為了了解Pg MTS01和大腸桿菌是否表現(xiàn)出亞型特異性LPS免疫原性的差異，作者測定了它們對細胞活化的影響。結果發(fā)現(xiàn)Pg-LPS顯示出對EC-LPS活性的拮抗作用。

圖5 | 從Pg-LPS中純化的LPS能拮抗大腸桿菌引起的炎癥反應

Pg-LPS改善CS誘導的COPD綜合征

隨后，作者研究了Pg-LPS在改善CS-誘導的COPD發(fā)病機制方面的潛力。由于腹腔內(nèi)（i.p.）施用促炎性LPS會促進COPD的肺氣腫發(fā)展，于是作者測試了Pg-LPS對CS小鼠的i.p.處理效果，對COPD進行表型分析。與CS小鼠相反，Pg-LPS治療在低劑量和高劑量下分別使體重增加18%和13.9%（圖6A，B），減少BALF細胞浸潤（圖6C），并使肺部病理學和功能正常化（圖6D-I）。此外，Pg-LPS減少了COPD小鼠肺組織（圖6J，K）和結腸（圖6L，M）中促炎癥細胞因子的過度表達，如IL-1β和TNF-α。同時，COPD小鼠支氣管肺泡灌洗液（圖6N）和血清（圖6O）中增加的LPS濃度和活性都被Pg-LPS顯著降低。進一步的研究表明，用Pg-LPS處理的對照組小鼠的肝臟和腎臟功能正常。因此，推測Pg MTS01來源的LPS改善了CS誘導的小鼠COPD。

圖6 | Pg-LPS可改善CS小鼠COPD的發(fā)展

研究討論

腸道微生物群組成顯著影響CS誘導的COPD發(fā)展，糞便微生物群移植后可改善COPD。分離出的共生細菌金氏擬桿菌，在減少腸道炎癥和增強結腸中的細胞線粒體和核糖體活性方面發(fā)揮重要作用，能夠系統(tǒng)地恢復血清中異常的宿主氨基酸代謝以及抑制肺部炎癥。研究證明Pg MTS01和Pg-LPS可能是改善COPD的潛在治療藥物。

小鹿推薦

通過單細胞RNA測序以及血清代謝組學分析，能夠了解糞便微生物群移植和抗生素治療對COPD的改善情況，從而評估腸道微生物群組成與肺免疫力之間存在的作用關系，來找到一些潛在的有益細菌菌株及其功能成分用以預防或治療COPD的替代藥。

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