1.開(kāi)發(fā)用于大規(guī)模功能篩選的藥物誘導(dǎo)性CRISPR-Cas9系統(tǒng)

應(yīng)用基因敲除CRISPR/Cas9技術(shù)的大規(guī)?；蚝Y選，現(xiàn)已成為了發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證基因功能的有力方法。在CRISPR細(xì)胞敲除篩選的過(guò)程中，控制基因擾動(dòng)時(shí)間的能力將有助于精確解剖動(dòng)態(tài)和復(fù)雜的生物過(guò)程。據(jù)報(bào)道，藥物誘導(dǎo)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化，允許在時(shí)間的控制下進(jìn)行高通量基因詢問(wèn)。

研究人員設(shè)計(jì)了多種藥物誘導(dǎo)的sgRNA表達(dá)載體，并使用EGFP基因破壞測(cè)定法在11種人的原代細(xì)胞和小鼠細(xì)胞系中測(cè)量了它們的活性。最佳設(shè)計(jì)可在體外和體內(nèi)對(duì)基因敲除進(jìn)行嚴(yán)格且可誘導(dǎo)的控制。接下來(lái)，使用誘導(dǎo)型和組成型CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行全基因組并行功能喪失篩選。在基于增殖的輟學(xué)篩選中，這兩種方法在區(qū)分必需的基因和非必需的基因方面具有相似的性能。在需要細(xì)胞因子刺激和細(xì)胞染色的更具挑戰(zhàn)性的表現(xiàn)分析中，科學(xué)家觀察到本構(gòu)和藥物誘導(dǎo)篩選方法在檢測(cè)已知命中中具有相似的敏感性。重要的是，在大規(guī)模設(shè)置中，在沒(méi)有化學(xué)誘導(dǎo)劑的情況下，我們的可誘導(dǎo)CRISPR篩選平臺(tái)的最小泄漏。

2.用誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9在人細(xì)胞中進(jìn)行有條件的基因敲除

易于編程和高效的CRISPR/Cas9核酸酶系統(tǒng)的出現(xiàn)徹底改變了基因工程。盡管使用CRISPR/Cas9進(jìn)行常規(guī)基因敲除實(shí)驗(yàn)非常有價(jià)值，但它們并不十分適合研究動(dòng)態(tài)情況（例如發(fā)育或疾病）中特定階段的基因功能。在這里，我們描述了一種基于CRISPR/Cas9優(yōu)化誘導(dǎo)型的基因敲除方法，用于人類細(xì)胞中的條件性功能喪失研究。此方法依賴于改進(jìn)的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)，用于條件表達(dá)驅(qū)動(dòng)Cas9活性的單向?qū)NA（sgRNA）。為了確保均勻且穩(wěn)定地表達(dá)，在對(duì)AAVS1基因組安全篩選中，能高效的進(jìn)一步遺傳工程后，表達(dá)了必要的轉(zhuǎn)基因。當(dāng)在人類多能干細(xì)胞（hPSC）中實(shí)施時(shí)，該方法實(shí)際上可以有效地應(yīng)用于處于發(fā)育或疾病各個(gè)階段的任何hPSC衍生的人類細(xì)胞類型。

3.使用CRISPR/Cas9基因工程技術(shù)誘導(dǎo)人類基因敲除人類干細(xì)胞

人類多能干細(xì)胞（hPSC），包括胚胎干細(xì)胞（ESC）和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC），是闡明人類遺傳背景下早期發(fā)育和疾病發(fā)病機(jī)制中調(diào)控過(guò)程的有用工具。基因修飾，包括基因敲除（KO），進(jìn)一步擴(kuò)展了hPSC在研究人類胚胎發(fā)生或人類遺傳疾病中的基因功能方面的實(shí)用性。因此，對(duì)hPSC中的基因敲除KO進(jìn)行精確的時(shí)間控制通常對(duì)于闡明構(gòu)成復(fù)雜人類特征基礎(chǔ)的基因功能和分子途徑通常是必要的或非常有益的?；虮磉_(dá)或缺失的精確時(shí)間控制對(duì)于闡明生物系統(tǒng)中的基因功能至關(guān)重要。然而，具有誘導(dǎo)基因敲除（iKO）的人類多能干細(xì)胞（hPSC）系的建立仍然具有挑戰(zhàn)性。因此，科學(xué)家探索了通過(guò)將CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯與Flp/FRT和Cre/LoxP系統(tǒng)相結(jié)合來(lái)構(gòu)建iKO hPSC系的方法，并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了一種策略，可以同時(shí)插入一個(gè)活性可控制的重組酶表達(dá)盒，并去除耐藥基因加快了iKO hPSC品系的產(chǎn)生。此兩步策略用于建立人類胚胎干細(xì)胞（hESC）和具有iKO的多能干細(xì)胞（iPSC）系，即SOX2，PAX6，OTX2和AGO2的iKO，這些基因表現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)布局和時(shí)間的表達(dá)模式。 iKO hPSC系的可用性將大大改變我們檢查人類細(xì)胞基因功能的方式。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成人糖基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢(shì)，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡(jiǎn)單，通過(guò)瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對(duì)GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測(cè)序，產(chǎn)生EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

Reference:

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