電泳允許通過?SDS-PAGE?分離的蛋白質(zhì)通過電泳轉(zhuǎn)移從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。在我們的蛋白質(zhì)印跡指南的第?3?部分中，Jackson公司詳細介紹了電印跡的過程以及對其成功至關(guān)重要的一些注意事項。

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在通過?SDS-PAGE?進行電泳之后，通過電泳轉(zhuǎn)移將分離的蛋白質(zhì)從凝膠上電印跡到膜上。聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)移膜在被夾在負電J（陰J）和正電J（陽J）之間之前直接接觸。

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陰J放置在凝膠后面，陽J放置在膜后面。當施加電壓時，蛋白質(zhì)從凝膠遷移到膜，在那里它們被固定。結(jié)果是膜上凝膠圖案的鏡像。然后在免疫檢測之前封閉印跡（電印跡膜）。

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圖：使用電印跡槽將蛋白質(zhì)從?SDS-PAGE?凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。

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Jackson公司：膜的類型

膜可由硝酸纖維素或聚偏二氟乙烯?(PVDF)?制成。

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硝酸纖維素

硝酸纖維素膜是非疏水性的，被認為通過非共價力與蛋白質(zhì)相互作用——靜電和疏水特性。

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硝酸纖維素很容易水合，并為大多數(shù)檢測方法提供低背景信號。

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然而，硝酸纖維素膜在干燥后會變脆，如果要進行替代蛋白質(zhì)的剝離和重新檢測，則難以處理。

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聚偏氟乙烯

PVDF?膜具有化學(xué)惰性，比硝酸纖維素膜更堅固，便于剝離和重新探測替代蛋白質(zhì)。PVDF?是疏水的，通過疏水和偶J相互作用與蛋白質(zhì)相互作用。因此，與硝酸纖維素膜相比，它們可以形成更強的相互作用，使它們能夠結(jié)合更多的蛋白質(zhì)（~150 μg cm2）。

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然而，更大的膜蛋白親和力可能會增加膜與一抗和二抗相互作用的可能性，從而增加背景信號的可能性。

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PVDF?可能會自發(fā)熒光，如果要進行熒光檢測以避免背景信號，則必須使用低熒光?PVDF?膜。由于?PVDF?的疏水性，膜在印跡之前需要在甲醇中“潤濕”。這使緩沖液能夠滲透基質(zhì)并使蛋白質(zhì)與膜結(jié)合。

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Jackson公司：Western Blotting?轉(zhuǎn)移步驟中需要考慮的因素

毛孔大小

如果感興趣的蛋白質(zhì)特別小或特別大，則可能需要考慮膜孔徑。

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較大的孔允許更大范圍的蛋白質(zhì)尺寸，但會增加小蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移過程中穿過膜的風(fēng)險。

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而較小的孔提供更大的結(jié)合表面，增加結(jié)合能力并減少小蛋白質(zhì)通過膜的機會。結(jié)合孔徑大小，應(yīng)考慮蛋白質(zhì)濃度。

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雖然膜和蛋白質(zhì)之間的高結(jié)合親和力確保了足夠的蛋白質(zhì)結(jié)合以進行準確的分析/檢測，但在高蛋白質(zhì)濃度下，這可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)自結(jié)合而不是蛋白質(zhì)-膜相互作用，并在洗滌步驟中導(dǎo)致蛋白質(zhì)損失。

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洗滌步驟

SDS?可以抑制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，因此聚丙烯酰胺凝膠可以用去離子水洗滌，然后放入轉(zhuǎn)移緩沖液中?15-30?分鐘以與緩沖液平衡。

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然而，在此過程中，小蛋白可能會從凝膠中遷移出來，因此在執(zhí)行洗滌步驟之前應(yīng)仔細考慮。懷疑樣品含有具有許多疏水性氨基酸或高分子量的蛋白質(zhì)，可以使用具有低濃度?SDS（0.02?至?0.1%）的轉(zhuǎn)移緩沖液來防止其沉淀。

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緩沖液?pH

轉(zhuǎn)移緩沖液保持高于蛋白質(zhì)等電點的?pH?值，確保它們保持負電荷并向陽J遷移。

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常見的轉(zhuǎn)移緩沖液使用?Towbin?系統(tǒng)（192 mM?甘氨酸、25 mM Tris、20%?甲醇）。這種低離子強度緩沖液的?pH?值為?8.3，高于大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點。

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除了鹽的類型和濃度，添加酸性或堿性溶液來調(diào)節(jié)?pH?值會影響離子含量，從而影響緩沖液的電導(dǎo)率。

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高離子水平會導(dǎo)致運行溫度升高，這可能會導(dǎo)致轉(zhuǎn)移效率低下并增加不良偽影的可能性。

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添加甲醇

可以將甲醇?(MeOH)?添加到轉(zhuǎn)移緩沖液中以提高蛋白質(zhì)膜轉(zhuǎn)移效率。添加?MeOH?可能會導(dǎo)致凝膠收縮，增加凝膠密度并延緩遷移，特別是對于高分子量蛋白質(zhì)。

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為了防止這種情況，凝膠在增加體積的甲醇中平衡，直到達到所需的濃度。

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建議使用分析級?MeOH，因為較低級別的甲醇可能含有金屬雜質(zhì)，會損壞儀器，因此應(yīng)避免使用。

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應(yīng)在使用前添加?MeOH，以防止緩沖液變質(zhì)或溶劑蒸發(fā)。

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電壓

組裝好凝膠膜夾層后，將盒子放入緩沖液罐中，并施加電壓以驅(qū)動蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。

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施加電壓的電壓強度和周期會影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的效率，必須針對每個系統(tǒng)進行優(yōu)化。

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短時間的低電壓會導(dǎo)致不完全轉(zhuǎn)移，而長時間的高電壓會加熱系統(tǒng)，導(dǎo)致不正確的轉(zhuǎn)移。

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高電壓也可能導(dǎo)致小蛋白質(zhì)通過膜而不結(jié)合。這可以通過在個膜后面放置一個額外的膜來捕獲這些多肽來觀察。

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理想情況下，應(yīng)優(yōu)化條件以確保所分析的所有大小的蛋白質(zhì)都能令人滿意地轉(zhuǎn)移。

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Jackson公司專注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務(wù)領(lǐng)域覆蓋各大學(xué)科研所和醫(yī)院里的動物研究以及生物醫(yī)學(xué)研究機構(gòu)的科學(xué)家。艾美捷科技是Jackson公司的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。