實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.? 了解熒光探針的基本知識(shí)

2．學(xué)習(xí)熒光顯微鏡的工作原理及使用方法

3.? 掌握細(xì)胞核和微絲骨架的標(biāo)記技術(shù)

實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞骨架：細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中由蛋白質(zhì)聚合而成的三維的纖維狀網(wǎng)架體系。細(xì)胞骨架包括微絲、微管和中間纖維。細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞形態(tài)，承受外力、保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性方面起重要作用。

鬼筆環(huán)肽是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細(xì)胞松弛素的作用相反,只與聚合的微絲結(jié)合,而不與肌動(dòng)蛋白單體分子結(jié)合。它同聚合的微絲結(jié)合后,抑制了微絲的解體,因而破壞了微絲的聚合和解聚的動(dòng)態(tài)平衡。DAPI是一種能與DNA特異性結(jié)合的熒光探針，所以被大量用于活細(xì)胞的觀察和定量的研究。

實(shí)驗(yàn)器材

熒光顯微鏡、載玻片、蓋片、滴管、濾紙、35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿

PBS緩沖液、0.5% Triton X-100、4%多聚甲醛、DAPI儲(chǔ)存液

55nM Alex-phalloidin（鬼筆環(huán)肽）

實(shí)驗(yàn)步驟

1.? 將細(xì)胞置于小蓋玻片上，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37℃, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%。

2.? 取出培養(yǎng)有細(xì)胞的小蓋玻片，置于小平皿中用37℃預(yù)溫 PBS輕輕漂洗3次。

3.? 加入37℃預(yù)溫4%多聚甲醛固定15min 。

4.? 用37℃預(yù)溫PBS漂洗3次。

5.? 加入0.5 % Triton X-100通透處理約10min。

6.? 用37℃預(yù)溫PBS漂洗3次。

7.? 取一個(gè)潔凈的載玻片，按照載玻片的大小在其上放置一條封口膜，在封口膜上滴加10ul 55nM Alexa-568-phalloidin (綠)，將經(jīng)上述處理的蓋玻片細(xì)胞面向下孵育于染色液中，室溫避光染色30min。

8.? 小心取下蓋玻片，將其置于小平皿中（細(xì)胞生長(zhǎng)的面朝上），用37℃預(yù)溫PBS避光漂洗3次。

9.? 在載玻片上分別滴加DAPI工作液10ul，將蓋玻片上的細(xì)胞倒扣在載玻片上室溫暗處孵育10 min。

10.? 封片。

11.? 熒光顯微鏡觀察微絲（藍(lán)色熒光激發(fā)，產(chǎn)生綠色熒光）；核（紫外光激發(fā)，產(chǎn)生藍(lán)色熒光）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

思考題

1、0.5%Triton X-100處理細(xì)胞的作用是什么？

0.5%Triton X-100處理細(xì)胞的作用是溶解細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)，增加細(xì)胞膜的通透性，使熒光染料能夠更容易地透過細(xì)胞膜與F-actin特異性結(jié)合。

2、鬼筆環(huán)肽用于細(xì)胞骨架研究的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？

（1）鬼筆環(huán)肽用于細(xì)胞骨架研究的優(yōu)點(diǎn)：鬼筆環(huán)肽的分子量小，很容易通過細(xì)胞，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷丙酮和TRITON X-100處理。鬼筆環(huán)肽可以與聚合的微絲結(jié)合，通過讓這種毒素吸附于熒光染料上面，可以研究細(xì)胞的內(nèi)部工作機(jī)制，窺視細(xì)胞如何分裂。

（2）鬼筆環(huán)肽用于細(xì)胞骨架研究的缺點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞有毒性，價(jià)格昂貴。