轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)常識介紹

轉(zhuǎn)染通常是指將核酸輸送到真核細胞，或者更明確地說是輸送到動物細胞內(nèi)。術(shù)語轉(zhuǎn)染一般用來表示原核生物感染病毒或噬菌體中病毒核酸的攝取，導(dǎo)致成熟病毒顆粒的感染和生成。但該術(shù)語現(xiàn)在的含義包括將外源性核酸人工導(dǎo)入細胞內(nèi)。

No.1

什么是轉(zhuǎn)染？

從廣義上講，轉(zhuǎn)染是采用除病毒感染外的其他方法將核酸(DNA或RNA)人工導(dǎo)入細胞的過程。采用各種化學(xué)、生物學(xué)或物理方法導(dǎo)入外源性核酸會改變細胞的特性，從而實現(xiàn)細胞基因功能和蛋白質(zhì)表達研究。轉(zhuǎn)染后，導(dǎo)入的核酸可以瞬時性地存在于細胞內(nèi)，只表達一段時間且不會復(fù)制，也可以穩(wěn)定地整合至受體基因組內(nèi)，隨著宿主基因組的復(fù)制而復(fù)制,各種基因輸送系統(tǒng)采用的術(shù)語與該領(lǐng)域的技術(shù)進展步調(diào)一致，并進一步區(qū)分不同的方法和細胞類型。

? 轉(zhuǎn)染

1

轉(zhuǎn)染通常是指將核酸輸送到真核細胞，或者更明確地說是輸送到動物細胞內(nèi)。術(shù)語轉(zhuǎn)染一般用來表示原核生物感染病毒或噬菌體中病毒核酸的攝取，導(dǎo)致成熟病毒顆粒的感染和生成。但該術(shù)語現(xiàn)在的含義包括將外源性核酸人工導(dǎo)入細胞內(nèi)。

? 轉(zhuǎn)化

2

轉(zhuǎn)化通常用來描述細菌、非動物真核細胞和植物細胞中非病毒DNA的轉(zhuǎn)移。但是，轉(zhuǎn)化還表示引起動物細胞表型發(fā)生性改變的特定事件或一系列事件，暗示遺傳不穩(wěn)定性及發(fā)展為癌癥狀態(tài)。盡管從這個意義上講，轉(zhuǎn)化可以源于轉(zhuǎn)化病毒的感染或基因轉(zhuǎn)染，也可以同時發(fā)生或在外來刺激物(如離子輻射或化學(xué)致突變源)刺激下產(chǎn)生。因此，在描述外源性遺傳物質(zhì)導(dǎo)入時，應(yīng)避免將該術(shù)語用于動物細胞。

? 轉(zhuǎn)導(dǎo)

3

轉(zhuǎn)導(dǎo)用于描述病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。但是，術(shù)語轉(zhuǎn)染也可以表示細胞的病毒核酸(從真核細胞病毒或噬菌體中分離)感染。

轉(zhuǎn)染的兩個主要目的是生成重組蛋白，或特異性地提升或抑制轉(zhuǎn)染細胞中的基因表達。因此，轉(zhuǎn)染是一種功能強大的分析工具，可用于基因或基因產(chǎn)物的功能和調(diào)控研究，用于生成轉(zhuǎn)基因生物，并用作基因治療方法。

No.2

轉(zhuǎn)染目的

? 基因表達

1

轉(zhuǎn)染最常通過使用質(zhì)粒載體或mRNA在培養(yǎng)細胞(或動物模型)中表達目的蛋白。利用真核細胞中的蛋白表達可以生成經(jīng)過適當折疊和翻譯后修飾的重組蛋白。另外，將帶有可檢測的標記物及其他修飾的蛋白質(zhì)導(dǎo)入細胞，可用于啟動子和增強子序列或蛋白:蛋白相互作用的研究。

此外，根據(jù)轉(zhuǎn)染策略的不同，轉(zhuǎn)染還可應(yīng)用于各種形式的生物生產(chǎn)。例如，導(dǎo)入重編程轉(zhuǎn)錄因子可以生成誘導(dǎo)多能性干細胞(iPSC)。另一方面，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染提供了不同治療分子的生物生產(chǎn)方法。

? 基因抑制

2

轉(zhuǎn)染的另一個常用用途是通過RNA干擾(RNAi)抑制特定蛋白質(zhì)的表達。在哺乳動物細胞中，利用內(nèi)源性表達的非編碼RNA，以microRNA(miRNA)的形式-來源于雙鏈RNA(dsRNA)前體-完成RNAi。前體被加工成成熟miRNA，成為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的一部分，抑制互補靶mRNA的翻譯。載體系統(tǒng)表達miRNA前體或短發(fā)夾RNA(shRNA)前體，它們通過內(nèi)源性機制分別生成miRNA或shRNA，然后抑制基因表達。利用這些系統(tǒng)可以實現(xiàn)重組體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并允許前體分子的誘導(dǎo)型表達。

化學(xué)合成的短/小分子干擾RNA(siRNA)還可以整合形成RISC，通過靶向互補mRNA(降解)誘導(dǎo)基因沉默。siRNA修飾有助于防止脫靶效應(yīng)，還可以確保dsRNA的活性鏈整合至RISC中。

No.3

轉(zhuǎn)染類型

將核酸導(dǎo)入細胞的生物、化學(xué)和物理方法有很多種。并非所有方法均適用于所有的細胞類型和實驗應(yīng)用，不同方法的轉(zhuǎn)染效率、細胞毒性、對正常生理學(xué)的影響和基因表達水平各異。但是，所有轉(zhuǎn)染策略均可分為兩大類，其中一些導(dǎo)入核酸在細胞中存在一段時間(瞬時轉(zhuǎn)染)，而另一些則長時間存在于細胞中，并被傳遞至轉(zhuǎn)染細胞的子代(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)。

? 瞬時轉(zhuǎn)染

1

在瞬時轉(zhuǎn)染中，導(dǎo)入核酸只在細胞中存在一段時間，且未整合至基因組。因此，在細胞分裂過程中，瞬時轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)不會傳遞至下一代，其會在環(huán)境因素影響下丟失或在細胞分裂過程中被沖淡。但高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)會引起蛋白質(zhì)的高水平表達(在其存在于細胞期間)。

根據(jù)使用的重組體的不同，瞬時表達的轉(zhuǎn)基因可以在1至7天內(nèi)檢出，但瞬時轉(zhuǎn)染的細胞一般在轉(zhuǎn)染后24至96小時收獲。基因產(chǎn)物分析需要提取RNA或蛋白質(zhì)進行酶活性分析或免疫分析。更佳時間間隔取決于細胞類型、研究目標和導(dǎo)入基因特定的表達特性，以及報告基因達到穩(wěn)態(tài)所需的時間。但在數(shù)天內(nèi)，大部分外源性DNA會在核酸酶作用下降解或被細胞分裂沖淡；一周后便無法再測出。

使用超螺旋質(zhì)粒DNA進行瞬時轉(zhuǎn)染的效率更高，因為它能被細胞更高效地攝取。siRNA、miRNA、mRNA甚至蛋白質(zhì)也可用于瞬時轉(zhuǎn)染，但與使用質(zhì)粒DNA一樣，這些大分子需要達到高質(zhì)量和相對高純度。在轉(zhuǎn)染DNA進入細胞核轉(zhuǎn)錄的同時，轉(zhuǎn)染RNA仍保留在胞漿內(nèi)，它可在轉(zhuǎn)染(mRNA)幾分鐘內(nèi)表達或者與mRNA結(jié)合，使靶基因表達沉默(siRNA和miRNA)。

? 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

2

在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中，外源性DNA被整合至細胞基因組中，或者作為附著體質(zhì)粒存在。與瞬時轉(zhuǎn)染不同，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以使外源性DNA長期存在于轉(zhuǎn)染細胞及其子代細胞中。因此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以使導(dǎo)入基因在多代細胞中性地表達，適用于重組蛋白生產(chǎn)和外源性DNA表達的下游或長期效應(yīng)分析。但是，通常只有單個或幾個拷貝的外源性DNA被整合至穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的基因組中。正因如此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染基因的表達水平一般低于瞬時轉(zhuǎn)染基因的表達水平。

由于將外源性DNA穩(wěn)定整合至基因組中的概率相對較低，因此成功完成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染需要高效DNA導(dǎo)入和篩選含有DNA的細胞的方法。篩選穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)染DNA的細胞的最可靠方法之一是在用于轉(zhuǎn)染的DNA重組體中加入選擇標記物，然后經(jīng)過短暫的恢復(fù)期后，在細胞中應(yīng)用適當?shù)倪x擇壓力(參見第23頁的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的選擇)。

常用的選擇標記物是可傳遞對各種篩選藥物抗性的基因或可以補償轉(zhuǎn)染細胞系中缺陷必需基因的基因。使用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)時，未轉(zhuǎn)染的細胞或瞬時轉(zhuǎn)染細胞最終都會死亡，而表達一定水平的抗生素抗性基因或可以補償必需基因缺陷的細胞則可以存活。在某些情況下，還可以將轉(zhuǎn)染細胞中的表型或形態(tài)學(xué)變化用作可篩選的特性。例如，采用源于牛乳頭瘤病毒的載體轉(zhuǎn)染小鼠CI127細胞，可出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化(Sarveretal.1981)。盡管相比超螺旋DNA，細胞對線性DNA的攝取量較低，但它可以將DNA更佳整合至宿主基因組中(參見第30頁的影響轉(zhuǎn)染效率的因素)。一般而言，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染僅限于DNA載體，但使用選擇性DNA載體制備短發(fā)夾轉(zhuǎn)錄本，亦可將siRNA和miRNA穩(wěn)定導(dǎo)入細胞內(nèi)(參見第50頁的載體介導(dǎo)的RNAi)。但是，RNA分子本身無法用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

No.4

選擇轉(zhuǎn)染策略

決定您需要瞬時轉(zhuǎn)染還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的因素是您所進行實驗的時間范圍和最終目標。瞬時轉(zhuǎn)染細胞一般在轉(zhuǎn)染后24–96小時收集，常用于研究基因或基因產(chǎn)物的短期表達效應(yīng)，執(zhí)行RNA干擾(RNAi)介導(dǎo)的基因沉默，或者快速生成小量重組蛋白。mRNA瞬時轉(zhuǎn)染可以更快速地提供結(jié)果；因為mRNA在胞漿中表達，無需轉(zhuǎn)移到細胞核，無需轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染數(shù)分鐘后即可在部分系統(tǒng)中表達轉(zhuǎn)染mRNA。

相比之下，當需要長期基因表達或轉(zhuǎn)染細胞需要在多個實驗中使用時，則更多地選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。由于將DNA載體整合至染色體中的概率較低，因此細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染更麻煩、更具挑戰(zhàn)性，需要選擇性篩選和克隆分離。因此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通常用于大規(guī)模的蛋白質(zhì)生產(chǎn)、長期藥理學(xué)研究、基因治療或長期基因調(diào)控機制研究。

隨著轉(zhuǎn)染試劑的問世，盡管哺乳動物細胞的瞬時轉(zhuǎn)染已可用于經(jīng)過適當折疊和翻譯后修飾(當表達細菌細胞重組蛋白時則不適用)的重組蛋白的生產(chǎn)，表達毫克至克級重組蛋白則主要依賴于建立穩(wěn)定的細胞系。最近，采用懸浮培養(yǎng)的HEK293和CHO細胞進行大規(guī)模的瞬時轉(zhuǎn)染，可以獲得大量重組蛋白，且無需經(jīng)過麻煩的穩(wěn)定細胞系建立過程。研究人員使用目的載體和懸浮培養(yǎng)的CHO或HEK293細胞，利用瞬時轉(zhuǎn)染進行重組蛋白表達，可在3至7天內(nèi)生成毫克/升級正確折疊和糖基化的重組蛋白。

Expi293?表達系統(tǒng)是瞬時表達技術(shù)的一次巨大進步，可在哺乳動物細胞中實現(xiàn)快速且超高產(chǎn)量的蛋白生產(chǎn)。Expi293?表達系統(tǒng)采用Expi293?表達培養(yǎng)基對Expi293F?細胞進行高密度培養(yǎng)，使用基于陽離子脂質(zhì)體的ExpiFectamine?293轉(zhuǎn)染試劑，結(jié)合優(yōu)化轉(zhuǎn)染增強劑進行轉(zhuǎn)染。所有組分協(xié)同作用，生成的蛋白產(chǎn)量較傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)(如FreeStyle?29表達系統(tǒng))高2至10倍，IgG和非IgG蛋白的表達水平可達>1g/L。臨床生物治療藥物通常使用穩(wěn)定的高表達轉(zhuǎn)染子生產(chǎn)，因為它們可以在極大規(guī)模的生產(chǎn)中實現(xiàn)批次間一致性和低成本。但在許多藥物開發(fā)應(yīng)用中，采用瞬時轉(zhuǎn)染方法快速篩選蛋白重組體具有一定的優(yōu)勢，可以在不到一周內(nèi)同時評估不同的候選分子。在許多情況下，可以在進行瞬時轉(zhuǎn)染的同時建立穩(wěn)定細胞系(更費時費力，需要三個月以上)。