背景介紹：

細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡間平衡的維持對多種細(xì)胞有機(jī)的發(fā)育與生命的維持至關(guān)重要，其失衡將導(dǎo)致各?種疾病的發(fā)生.如：人類平均每天有?6×10（10）個(gè)新細(xì)胞生成，同時(shí)又接近同等數(shù)量的成熟細(xì)胞被機(jī)體清除.在細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡間存在一種配對關(guān)系，因此區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞對研究生長條件的控制和 細(xì)胞死亡過程都是十分重要的。

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工作原理：

活/死細(xì)胞雙染色試劑盒（綠/紅），提供了一種方便的測定方法，以評估細(xì)胞的活力，它基于使用兩種探針同時(shí)測定活細(xì)胞和死細(xì)胞的方法，這些探針測量公認(rèn)的細(xì)胞健康參數(shù)：質(zhì)膜完整性和細(xì)胞內(nèi)酯酶活性。該試劑盒利用可滲透細(xì)胞的綠色熒光染料?LiveDye（Ex / Em = 488/530 nm）染色活細(xì)胞，并使用不可滲透細(xì)胞的紅色熒光染料?NucleiDye（Ex / Em = 535/617）用來染死細(xì)胞。

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活/死細(xì)胞雙染色試劑盒#AMJ-KT0005：

類型?細(xì)胞分析

檢測方法?熒光顯微鏡，流式細(xì)胞術(shù)；

活細(xì)胞綠色熒光染料?LiveDye（Ex / Em = 488/530 nm）死細(xì)胞紅色熒光染料?NucleiDye（Ex / Em = 535/617）

運(yùn)輸?冰袋運(yùn)輸

保存?請參閱說明書中各個(gè)組分的存儲條件。

自發(fā)貨之日起，在推薦溫度下至少穩(wěn)定?12?個(gè)月。

其它?默認(rèn)使用?24?孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

*?注意事項(xiàng)

1）為了安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2）NucleiDye?是一個(gè)潛在的誘變因子，使用本試劑時(shí)應(yīng)采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施

3）LiveDye?需要在干燥低溫避光條件下儲存，儲存溫度為-20℃。

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需用戶自行準(zhǔn)備：

離心機(jī)

移液器及吸頭

熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀

24?孔板（細(xì)胞培養(yǎng)用）

磷酸鹽緩沖液?(PBS)

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活/死細(xì)胞雙染色試劑盒（綠/紅）特點(diǎn)：

1.針對哺乳動物細(xì)胞染色進(jìn)行優(yōu)化

2.可用于使用流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡，快速定量細(xì)胞活力

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使用方法：

*[Note]?本實(shí)驗(yàn)中選擇的細(xì)胞為?HeLa?細(xì)胞。由于不同類型細(xì)胞的zui佳染色條件不同，LiveDye和?NucleiDye?的zui佳染色濃度會有所不同。

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一．試劑準(zhǔn)備：

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A.活細(xì)胞-綠色染料（LiveDye）：冰上避光放置。

B.死細(xì)胞-紅色染料（NucleiDye）：冰上避光放置。

C.實(shí)驗(yàn)緩沖液?(10×) [Assay Buffer(10×)]：用?ddH20?稀釋?10x?實(shí)驗(yàn)緩沖液，至?1x?實(shí)驗(yàn)緩沖液（工作液）。使用前預(yù)熱到?37C。

D.染色工作液：每?1 ml?的實(shí)驗(yàn)緩沖液（1X）中，加入?1ul?活細(xì)胞-綠色染料（LiveDye）和?1ul?死細(xì)胞-紅色染料（NucleiDye），混合均勻（適用于2個(gè)樣品孔，每孔0.5ml）。如有大量樣品，請成比例的擴(kuò)大染色工作液配置。

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二．

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（一）熒光顯微鏡：

1.用預(yù)期的方法處理細(xì)胞，在不含誘導(dǎo)劑條件下孵育細(xì)胞建立陰性對照組；

2.對于貼壁細(xì)胞，在?24?孔板的蓋玻片上種植和培育細(xì)胞，在?CO2?細(xì)胞培養(yǎng)箱中?37°C?培養(yǎng)至少?24?小時(shí)。先用細(xì)胞刮刀或者胰酶-EDTA?消化細(xì)胞，之后離心收集細(xì)胞（1000 rpm，3 min）。

對于懸浮細(xì)胞，直接離心(4℃, 300g, 5 min）收集細(xì)胞。

3.用?PBS?洗滌細(xì)胞兩次，移除液體。

4.在?24?孔板中，每個(gè)孔加入?0.5ml?染色工作液來，37℃避光孵育?15-30 min。

5.用?PBS?洗滌細(xì)胞兩次。

6.將蓋玻片覆蓋到載玻片上，盡快使用適當(dāng)?shù)臑V光片通過熒光顯微鏡分析細(xì)胞。

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*[Note]?：為了獲得zui佳效果，可以使用抗熒光淬滅劑對其進(jìn)行觀察。

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（二）流式細(xì)胞分析：

1.用預(yù)期的方法處理細(xì)胞。

*[Note]?：對于所有的處理和未處理的細(xì)胞樣本，建議把未染色的對照組細(xì)胞懸浮在實(shí)驗(yàn)緩沖液（不含有?LiveDye?和?NucleiDye），用于流式細(xì)胞分析；

2.對于非貼壁細(xì)胞，收集?1-5?×105?個(gè)細(xì)胞離心?(4℃, 300g, 5 min)，用預(yù)冷的?PBS?洗滌

2?次，棄去?PBS。對于貼壁細(xì)胞，先用胰蛋白酶（不含?EDTA）消化細(xì)胞，然后離心去上清。

3.用?500ul?染色工作液來懸浮細(xì)胞。

4.避光孵育?15-30 min。

5.使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行相應(yīng)檢測與分析。

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相關(guān)研究工具：

貨號?名稱?規(guī)格

AMJ-AB1001?β-actin?單克隆抗體(AJ01)?30ul, 100ul, 1ml

AMJ-AB1002?GAPDH?單克隆抗體(1B4)?30ul, 100ul, 1ml

AMJ-AB1003?β-Tubulin?單克隆抗體(2B5)?30ul, 100ul, 1ml

AMJ-AB1004?植物Actin?單克隆抗體(2G2)?30ul, 100ul, 1ml

AMJ-AB1005?Flag?標(biāo)簽單克隆抗體(2B9)?30ul, 100ul, 1ml

AMJ-AB1006?HA?標(biāo)簽單克隆抗體(3F5)?30ul, 100ul, 1ml

AMJ-AB1007?His?標(biāo)簽單克隆抗體(4C2)?30ul, 100ul, 1ml

AMJ-CH0001?預(yù)染蛋白分子量?Marker（10-180 kDa）?100ul, 250ul, 250ul*10

AMJ-CH0002?蛋白酶抑制劑套裝（100X）?1ml, 1ml*2, 1ml*5

AMJ-KT0002?WB?超敏ECL?底物試劑盒?50ml, 200ml, 1L

AMJ-KT0006?核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒?50T, 200T

AMJ-KT0007?總蛋白提取試劑盒?50T, 200T

AMJ-KT0008?BCA?蛋白質(zhì)定量試劑盒（兼容SDS）?500T, 2000T, 5000T

AMJ-KT0009?Bradford?蛋白質(zhì)定量試劑盒（兼容DTT）?500T, 2000T, 5000T