寫在前面

????????今天推薦的是由蘇州大學藥學院在2019年6月13日發(fā)表于Acta Pharmacologica Sinica（IF：5.063，JCR醫(yī)學1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Tie Zhang教授，研究表明甲苯達唑通過抑制USP5/c-Maf軸引發(fā)強烈的抗骨髓瘤活性。

研究背景

????????多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種源自產生抗體的漿細胞的血液學惡性腫瘤。MM的特點是基因突變和染色體畸變，包括缺失、倒位、互換和易位。這些基因異常導致MM患者對個別治療藥物的反應不一。c-Maf是一個關鍵的致癌轉錄因子，有助于骨髓瘤的發(fā)生。以前的研究表明，去泛素酶USP5能穩(wěn)定c-Maf并促進骨髓瘤細胞的增殖和生存；因此，USP5/c-Maf軸可能是骨髓瘤治療的一個潛在目標。

摘要部分

????????該研究建立了一個基于USP5/c-Maf的熒光素酶系統(tǒng)，用于篩選一個FDA批準的藥物庫。研究發(fā)現，甲苯達唑，一種典型的抗蠕蟲藥物，優(yōu)先誘導表達c-Maf的骨髓瘤細胞凋亡。此外，口服甲苯達唑可延緩人骨髓瘤異種移植在裸鼠體內的生長，但沒有顯示出明顯的毒性。進一步研究表明，甲苯達唑的選擇性抗骨髓瘤活性與抑制USP5/c-Maf軸有關。甲苯達唑下調了USP5的表達，破壞了USP5和c-Maf之間的相互作用，從而導致c-Maf泛素化和隨后c-Maf降解的水平增加。甲苯達唑抑制了c-Maf的轉錄活性，這一點在熒光素酶試驗和c-Maf下游基因的表達測量中都得到了證實?？傊?，本研究發(fā)現甲苯達唑是一種USP5/c-Maf抑制劑，可以作為一種新型的抗骨髓瘤藥物進行開發(fā)。

研究內容

1.通過中間通量篩選確定c-Maf /USP5抑制劑? ? ?

????????作者以前的研究表明，靶向USP5會導致c-Maf降解和多發(fā)性骨髓瘤（MM）細胞死亡，這表明USP5/c-Maf軸是MM的一個潛在治療目標。為了確定USP5/c-Maf軸的抗MM抑制劑，作者建立了一個基于c-Maf和USP5存在下MARE驅動的熒光素酶活性的篩選系統(tǒng)。結果顯示，在有USP5和轉錄因子c-Maf的情況下，1700種藥物中的30種使熒光素酶的活性降低了50%以上。

????????在第二個篩選中，用上述所有藥物處理MM細胞系LP1（其表達高水平的c-Maf）然后進行IB檢測，以評估PARP剪切和c-Maf降解。最終選擇甲苯達唑進行進一步研究。甲苯達唑降低了c-Maf蛋白的表達，但對其mRNA水平沒有影響，其在骨髓瘤治療中的潛在應用尚未有報道。

研究結論：鑒定甲苯達唑為c-Maf蛋白降解的促進劑。

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2.甲苯達唑抑制USP5/c-Maf軸并通過泛素-蛋白酶體途徑誘導c-Maf降解? ? ?

????????作者試圖確定甲苯達唑是否可以通過c-Maf的泛素化來抑制USP5的活性。為此，作者首先測量了甲苯達唑處理過的MM細胞中c-Maf和USP5的水平。結果顯示，在LP1和RPMI-8226細胞中，甲苯達唑同時下調了USP5和c-Maf的蛋白表達。正如預期的那樣，甲苯達唑未能下調c-Maf的mRNA表達。? ? ? ?

????????由于c-Maf的周轉是通過蛋白酶體處理的，作者試圖確定甲苯達唑誘導的c-Maf降解是否能被蛋白酶體抑制劑所逆轉。為此，用甲苯達唑處理LP1和RPMI-8226細胞，然后用MG132處理。IB檢測結果顯示，甲苯達唑使c-Maf下調，但這種下調被典型的蛋白酶體抑制劑MG132所回補，這表明甲苯達唑通過泛素-蛋白酶體途徑誘導c-Maf降解。

????????作者接下來試圖確定甲苯達唑是否能干擾c-Maf和USP5的關聯。因此，作者首先評估了甲苯達唑存在下USP5和c-Maf之間的相互作用。結果顯示，在HEK293T和MM細胞中，無論在外源性還是內源性背景下，甲苯達唑都降低了c-Maf免疫沉淀物中的USP5含量，這表明USP5和c-Maf之間的相互作用被甲苯達唑所破壞。另一方面，IP/IB檢測結果顯示，甲苯達唑增加了所有三個細胞系中c-Maf的多泛素化水平。

研究結論：甲苯達唑阻止了USP5介導的c-Maf去泛素化并導致c-Maf降解。

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3.甲苯達唑抑制c-Maf的轉錄活性??? ?

????????上述結果表明，甲苯達唑抑制了USP5/c-Maf軸，促進了c-Maf的降解；因此，甲苯達唑可能下調了c-Maf的轉錄活性。為了證實這一假設，作者用螢火蟲熒光素酶作為c-Maf識別元件（MARE）調控下的報告蛋白。從測量的熒光素酶活性來看，USP5的異位表達明顯增加了c-Maf的轉錄活性。值得注意的是，這種活性被甲苯達唑以濃度依賴的方式明顯抑制。

????????為了證實這一發(fā)現，將表達c-Maf的LP1和RPMI-8226以及c- Maf缺陷的U266細胞系用甲苯達唑處理然后用RT-PCR測量基因轉錄水平。結果顯示，在表達c-Maf的LP1和RPMI- 8226細胞中，甲苯達唑降低了所有三個基因--CCND2、ARK5和ITGB7的mRNA水平，而在缺乏c-Maf的U266細胞中則不然。為了證實這些發(fā)現，作者接下來進行了定量實時PCR來測量所有基因的表達。與上述檢測結果一致，甲苯達唑下調了USP5、CCND2、ITGB7和ARK5的轉錄，但對c-Maf的轉錄沒有影響。

研究結論：甲苯達唑通過抑制USP5誘導c-Maf的降解來影響c-Maf的轉錄活性。

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4.甲苯達唑優(yōu)先誘導表達c-Maf的多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡? ???

????????作者接下來評估了甲苯達唑對多發(fā)性骨髓瘤細胞生存和凋亡的影響。為此，作者將MM細胞系LP1、RPMI-8226和U266暴露于甲苯達唑然后進行IB檢測。表達c-Maf的LP1和RPMI-8226細胞中，凋亡標志物PARP和caspase-3的剪切和激活都明顯增加。相反，在缺乏c-Maf的U266細胞中檢測到較低水平的PARP剪切片段。這些發(fā)現表明，甲苯達唑可能優(yōu)先誘導表達c-Maf的MM細胞的凋亡。

????????為了進一步證實這一假設，將所有三個MM細胞系暴露于極低濃度（0.5μM）的甲苯達唑，然后進行Annexin V/PI染色和流式細胞儀分析。0.5μM的甲苯達唑在LP1和RPMI-8226細胞中誘導了明顯的細胞凋亡，但在U266細胞中沒有，這表明U266細胞由于缺乏c-Maf的表達而對甲苯達唑不太敏感。

研究結論：甲苯達唑優(yōu)先誘導MM細胞凋亡，其方式依賴于c-Maf的表達。

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5.甲苯達唑與一種USP5抑制劑發(fā)揮協(xié)同抗骨髓瘤作用? ? ?

????????以前的研究發(fā)現WP1130是一種小分子化合物，可以抑制USP5的去泛素酶活性。作者試圖確定該藥與甲苯達唑是否能協(xié)同誘導MM細胞凋亡。為此，作者用WP1130和甲苯達唑單獨或聯合處理LP1和RPMI-8226細胞，然后用IB試驗研究PARP剪切。結果顯示，極低濃度下，PARP沒有被WP1130或甲苯達唑明顯剪切；然而，這兩種藥劑的共同處理使其明顯剪切。因此，甲苯達唑和WP1130的聯合治療顯示了對MM的協(xié)同作用。

????????作者接下來研究了甲苯達唑與達烏魯比星（一種典型的抗MM藥物）聯合使用的效果。這兩種藥物單獨誘導有限的PARP剪切，但聯合治療明顯增加PARP剪切。

研究結論：甲苯達唑和USP5抑制劑或抗MM藥物（如達諾魯比星）之間有明顯的協(xié)同作用。

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6.甲苯達唑可延緩裸鼠模型中人類多發(fā)性骨髓瘤異種移植的生長

????????為了進一步研究甲苯達唑對人類多發(fā)性骨髓瘤的體內作用，通過在裸鼠右腹皮下注射LP1或RPMI-8226細胞建立了兩個骨髓瘤異種移植模型。小鼠實驗發(fā)現，甲苯達唑明顯減少了腫瘤的生長，而且這種影響是劑量依賴性的。并且，通過體重測量和血液生化分析，甲苯達唑并沒有顯示出對小鼠的毒性，結果表明，甲苯達唑的耐受性良好。

????????隨后，作者分析了甲苯達唑對多發(fā)性骨髓瘤異種移植的影響。在對接受治療的小鼠的腫瘤組織進行的IB試驗中，USP5和c-Maf在接受甲苯達唑治療的小鼠的腫瘤組織中減少，而在未接受治療的小鼠的腫瘤組織中沒有減少。此外，caspase-3和PARP在經甲苯達唑處理的小鼠組織中也被剪切，這表明甲苯達唑也能誘導體內MM細胞凋亡。

研究結論：甲苯達唑通過抑制USP5/c-Maf軸在體內顯示出明顯的抗MM活性。

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結論與討論

????????研究發(fā)現甲苯達唑通過抑制USP5/c-Maf軸而成為一種有效的、有前途的抗骨髓瘤藥物。本研究是第一個關于通過靶向c-Maf泛素化和蛋白體降解治療骨髓瘤的報告。鑒于甲苯達唑的高安全性和單獨或與其他藥物聯合使用的強效抗骨髓瘤活性，甲苯達唑有望被重新用于個性化的多發(fā)性骨髓瘤治療。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41401-019-0249-1