精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代到來推動了大樣本研究飛速發(fā)展。數(shù)據(jù)非依賴采集（DIA）蛋白質(zhì)組技術(shù)，因其無偏向采集樣本中所有信息，帶來DDA蛋白質(zhì)組無法達到的高重復(fù)性、高穩(wěn)定性、定量精確性，這些優(yōu)勢與大樣本要求高度契合，使DIA成為當(dāng)下大樣本分析首選技術(shù)。

然而實際分析中，仍有一些其他困難和需求：1. 由于臨床樣本取樣困難或極其珍貴，“如何實現(xiàn)更微量樣本分析？”是許多研究者需求，這給DIA分析的靈敏度提出更高要求。2.由于大樣本動輒百例甚至千例分析規(guī)模，“如何加速項目分析速度？”意味著不僅要確保數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，同時對DIA檢測通量也提出了極大挑戰(zhàn)。

2020年12月，來自馬普所Matthias Mann、多倫多大學(xué)Hannes R?st、蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院Ben C.Collins、Ruedi Aebersold等諸多領(lǐng)域頂尖科學(xué)家團隊，在Nature Methods (IF=30.822) 發(fā)表“diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition”文章，聯(lián)合開發(fā)了基于離子淌度平臺的DIA技術(shù)——diaPASEF，在保證當(dāng)下DIA優(yōu)勢的同時，加持離子淌度分離，帶來鑒定深度、微量樣本檢測靈敏度提升；此外，基于Evosep One高通量色譜搭配PASEF高速掃描方式，在鑒定能力及穩(wěn)定性得到保證的同時，進一步實現(xiàn)大樣本高通量分析。

dia-PASEF?原理

dia-PASEF蛋白質(zhì)組，是在DIA技術(shù)上加持離子淌度（ion mobility）分離，它根據(jù)肽段離子形狀屬性不同，提供色譜、質(zhì)譜分離外的新一維度分離，從而有效降低質(zhì)譜解析復(fù)雜度，提升鑒定能力?；趖imsTOF Pro質(zhì)譜分析儀，搭載了雙捕集離子淌度分析裝置（TIMS），使肽段離子在兩個TIMS中先后累積分離，并能同步運行，這種平行累積連續(xù)碎裂（PASEF）的工作方式，使離子利用率極高且掃描速度獲10倍以上提升。

在dia-PASEF模式中，對于給定電荷肽段離子，由于離子淌度與質(zhì)量具有相關(guān)性，故利用該特征設(shè)置DIA的母離子采集隔離窗口，不會丟失窗口外的離子信號。如下圖，根據(jù)TIMS時間逐步調(diào)整的隔離窗口，2+、3+電荷下近乎大部分母離子均被采集到。

dia-PASEF?實現(xiàn)數(shù)據(jù)采集效率大幅提升

為了比較DDA、DIA、diaPASEF數(shù)據(jù)采集效果，分別采用簡單、復(fù)雜樣本進行了測試。對于簡單樣本，采用BSA酶解的肽段樣本進行三種方法（45min梯度）比較分析，抽取DLGEEHFK碎片離子色譜圖比較，結(jié)果表明，DDA分析中僅有<1%的離子束轉(zhuǎn)換為碎片離子；傳統(tǒng)DIA分析中雖能構(gòu)建色譜峰形狀，但也只<5%離子束轉(zhuǎn)換為碎片離子；但在diaPASEF模式下，實現(xiàn)了近100%離子采集能力。對于復(fù)雜樣本，采用HeLa細胞酶解肽段樣本進行比較分析，從離子流結(jié)果分析，DDA模式中離子流強度最低、DIA模式比DDA離子流強度高3倍，而diaPASEF（4 scans）模式離子流強度又高出DIA達5倍。綜上，diaPASEF在簡單或復(fù)雜樣本分析中均顯著提高離子采集效率。

dia-PASEF?實現(xiàn)鑒定高深度與定量準(zhǔn)確性

為了在典型DIA實驗步驟下測試dia-PASEF 鑒定深度和覆蓋度，采用Hela樣本進行建庫和樣本分析。首先在24級分級基礎(chǔ)上，構(gòu)建了含9140種蛋白的DDA PASEF譜圖庫，隨后對每個樣本進行120分鐘diaPASEF分析，結(jié)果表明3次重復(fù)實驗共鑒定達7800個蛋白，每個樣平均鑒定達7601個蛋白，且定量動態(tài)范圍跨越四個數(shù)量級，表明了該技術(shù)極佳的鑒定深度。此外，3次重復(fù)實驗中共同定量蛋白達7348個，相對于鑒定總數(shù)來說完整性高達94%，體現(xiàn)了極高的數(shù)據(jù)覆蓋完整度。

為了確認(rèn)在復(fù)雜混合樣本中仍能實現(xiàn)定量準(zhǔn)確性，將僅15ng酵母肽段樣本摻入200 ng人源肽段樣本（HeLa）中，進行3次重復(fù)檢測。結(jié)果表明，盡管低豐度酵母摻入量僅占7％，但至少有兩次重復(fù)鑒定到7697種人蛋白、1394種酵母蛋白，且蛋白質(zhì)豐度比根據(jù)混合比例明顯區(qū)分為兩個不同的群體。人源蛋白在整個豐度范圍內(nèi)以1：1的比例聚集(σ(log2) = 0.22)，低豐度酵母摻入蛋白定量總體精度較低(σ(log2) = 0.70)。綜上，diaPASEF能準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)豐度變化。

dia-PASEF實現(xiàn)微量樣本的高靈敏度檢測

為了進一步挑戰(zhàn)微量樣本檢測靈敏度極限。首先，對diaPASEF掃描次數(shù)、四極桿隔離寬度等優(yōu)化，保證微量樣本中更高效的母離子肽段采集。結(jié)果表明，優(yōu)化的diaPASEF實現(xiàn)了對低峰度肽段更好的檢測效果，使肽段檢測范圍擴大約4倍。針對僅10 ng HeLa肽段樣本的120min梯度分析，3次重復(fù)共定量蛋白質(zhì)仍然能達4310個，且在至少2次重復(fù)中定量蛋白數(shù)達3909。綜上，dia-PASEF能實現(xiàn)極低樣本量的高靈敏度鑒定分析。

dia-PASEF+ Evosep One實現(xiàn)大樣本高通量分析，帶來檢測速度提升

為了實現(xiàn)臨床大樣本的高通量分析需求，采用了具有快速周轉(zhuǎn)時間Evosep One色譜系統(tǒng)，其最快能達每天200個樣品分析速度；在質(zhì)譜方面，對PASEF高速掃描模式進行采集速度參數(shù)優(yōu)化，建立了不同檢測通量的方法(每日60、100、200個樣本)并進行測試。結(jié)果表明，每日60個樣本通量（21min梯度）方法下，Hela樣本三次重復(fù)共定量蛋白達5183，CV%中位數(shù)僅為5.8%, 即使通量增至每日100、200樣本時，三次重復(fù)仍然定量到超過4000、3000個蛋白，CV%中位數(shù)低于10%。綜上，dia-PASEF在大幅提升檢測通量的同時，仍然能保證鑒定深度以及數(shù)據(jù)結(jié)果穩(wěn)定性。

總結(jié)：

本研究建立了diaPASE工作流程，利用離子淌度與質(zhì)荷比具有相關(guān)性原理，優(yōu)化掃描參數(shù)，極大提升數(shù)據(jù)采集效率，確保深度鑒定、高靈敏度、高通量分析。在后續(xù)檢測分析中，不僅證明了diaPASEF在微量樣本中的極佳高靈敏度分析優(yōu)勢，而且證明了在大規(guī)模臨床研究中強大的高通量分析能力。