Nat子刊 : 新技術(shù)繪制小鼠中腦胚胎發(fā)育單細胞時空譜系圖譜
帕金森病是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元特異性丟失導致的以運動功能障礙為主要表型的神經(jīng)退行性疾病，移植干細胞分化得到的多巴胺能神經(jīng)前體細胞是治療帕金森病最具潛力的治療措施。
中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學研究所）陳躍軍研究組一直專注于人多能干細胞的神經(jīng)分化和帕金森病的細胞治療，在前期研究中建立了高效的人多巴胺能神經(jīng)細胞的分化方法（2016，Cell Stem Cell；2021，Cell Stem Cell），并進一步建立基于病毒條形碼標記的高通量克隆譜系示蹤新技術(shù)-SISBAR，解析了人多能干細胞分化為中腦多巴胺能神經(jīng)細胞的單細胞譜系（2023，Cell Stem Cell，Cover Story）。通過SISBAR技術(shù)，團隊成員意外發(fā)現(xiàn)在克隆水平，人中腦多巴胺能神經(jīng)前體細胞可以分化為中腦多巴胺能神經(jīng)元和中腦底板谷氨酸能神經(jīng)元，這一體外分化細胞譜系是否和內(nèi)源細胞的發(fā)育譜系一致？還是體外分化產(chǎn)生的假象？
傳統(tǒng)基于重組酶技術(shù)的譜系示蹤通量有限，一般只能示蹤1-2個譜系，并且沒有單克隆解析度。最近病毒條形碼標記技術(shù)也被應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育譜系的研究（Christian Mayer et al，2022 Nature；Jonas Frisén et al，2022 Nature Neuroscience），通過在側(cè)腦室注射條形碼標記的病毒，對腦室區(qū)（ventricular zone，VZ）的神經(jīng)干細胞進行標記，并結(jié)合單細胞測序?qū)@些細胞的子代細胞進行高通量譜系示蹤。然而，這種方法只能標記VZ區(qū)的神經(jīng)干細胞，無法實現(xiàn)對全腦任意位置神經(jīng)干細胞的標記，并且側(cè)腦室病毒注射的方法適用于神經(jīng)管閉合以后發(fā)育的腦區(qū)（通常E11天以后），而對于早期發(fā)育腦區(qū)，比如E8-8.5開始發(fā)育的中腦組織，則無法通過該方法進行標記。因此，急需開發(fā)一種能夠?qū)δX內(nèi)任意細胞群體進行高通量條形碼標記和譜系示蹤的新方法。
2023年7月17日，中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學研究所）陳躍軍研究組在Nature Methods上發(fā)表了題為Comprehensive spatiotemporal mapping of single-cell lineages in developing mouse brain by CRISPR-based barcoding的文章（利用CRISPR條形碼技術(shù)全面繪制小鼠腦內(nèi)的單細胞時空譜系）。該研究通過建立能夠應(yīng)用于小鼠體內(nèi)任意組織器官的譜系示蹤新技術(shù)——CREST，解析了小鼠中腦在胚胎發(fā)育過程中的單細胞時空譜系圖譜，揭示了小鼠中腦發(fā)育過程中新的譜系分化路徑和分子調(diào)控機制。CREST技術(shù)為高通量解析小鼠組織器官發(fā)育的單細胞譜系提供了全新的工具，為從譜系視角研究各種發(fā)育疾病的發(fā)病機制提供了新的研究工具。
團隊成員利用CRISPR介導的條形碼標記技術(shù)，并進一步結(jié)合重組酶系統(tǒng)和單細胞測序技術(shù)，開發(fā)了一種在體高通量譜系示蹤的方法——CREST，并構(gòu)建了相應(yīng)的譜系示蹤工具小鼠品系（圖A）。利用CREST技術(shù)，研究團隊繪制了全面的中腦發(fā)育譜系圖譜，從而深入探究中腦神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程和體內(nèi)中腦多巴胺能神經(jīng)細胞的發(fā)育譜系。
研究團隊首先利用基于CREST的“快照”策略（snapCREST），解析了特定發(fā)育時間點中腦不同細胞類型之間的譜系關(guān)系（圖B），發(fā)現(xiàn)了許多先前未被報導的亞區(qū)特異性的譜系關(guān)系：在翼板中，谷氨酸能神經(jīng)元與GABA能神經(jīng)元具有共同的譜系起源；而在基板中，這兩類神經(jīng)元具有相對獨立的起源；在底板中，谷氨酸能神經(jīng)元則與多巴胺能神經(jīng)元具有共同的起源（圖C）。研究團隊進一步在克隆水平對祖細胞的分化命運進行了無偏好的分類，發(fā)現(xiàn)單個中腦祖細胞的分化命運可以被分為六種主要類型。基于這一結(jié)果，研究團隊提出了“祖細胞原型”的概念，這六種中腦祖細胞原型囊括了中腦發(fā)育過程中單個中腦祖細胞的不同分化命運（圖D）。
研究團隊進一步在克隆水平對中腦底板神經(jīng)祖細胞的分化命運進行了分析，發(fā)現(xiàn)單個中腦底板神經(jīng)祖細胞存在三種不同的分化命運：中腦底板神經(jīng)祖細胞經(jīng)由中腦底板神經(jīng)母細胞，有的偏好分化成多巴胺能神經(jīng)元，有的偏好分化成谷氨酸能神經(jīng)元、有的則能同時分化成多巴胺能和谷氨酸能神經(jīng)元。通過對不同分化命運的底板神經(jīng)母細胞差異表達基因的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)，Pbx1轉(zhuǎn)錄因子在偏好產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元的底板神經(jīng)母細胞內(nèi)顯著高表達（圖E）。當Pbx1被敲除后，共釋放谷氨酸的中腦多巴胺能神經(jīng)元的比例顯著增加，這證明Pbx1在決定中腦底板來源神經(jīng)元的谷氨酸能表型和多巴胺能表型中的關(guān)鍵作用（圖F）。這些結(jié)果展示了CREST技術(shù)在克隆水平解析細胞命運決定分子機制中的強大能力。
圖注：（A）CREST小鼠示意圖。（B）“快照式”譜系示蹤實驗流程。（C）E15.5天胚胎腹側(cè)中腦的細胞類群間的譜系關(guān)系。（D）腹側(cè)中腦的六種祖細胞原型的分化命運示意圖。（E）偏好產(chǎn)生多巴胺或谷氨酸能神經(jīng)元的神經(jīng)母細胞中的差異表達基因。（F）Pbx1敲除造成Vglut2陽性的多巴胺能神經(jīng)元比例顯著增加。（G）“連拍式”譜系示蹤實驗流程。（H）單個中腦基板內(nèi)側(cè)神經(jīng)祖細胞的分化命運統(tǒng)計。
中科院昆明動物研究所徐敏副研究員、劉前進副研究員和畢蕊副研究員為該論文的共同第一作者，姚永剛研究員和張登峰研究員為共同通訊作者。該研究得到國家自然科學基金委、科技部、中國科學院和云南省等項目資助。
snapCREST可以解析特定發(fā)育時間點不同細胞類型之間的譜系關(guān)系，但是由于祖細胞在被用于單細胞測序后無法繼續(xù)分化，這一策略無法解析不同祖細胞類型在下一階段的分化命運。為此，研究人員進一步開發(fā)了基于CREST的“連拍”策略（pandaCREST）。該策略結(jié)合了克隆分離策略、類器官培養(yǎng)技術(shù)與CREST技術(shù)，實現(xiàn)了發(fā)育過程中單個祖細胞轉(zhuǎn)錄組信息及其分化潛能的同時獲得（圖G）。通過pandaCREST，研究人員解析了中腦不同轉(zhuǎn)錄組定義的祖細胞群的分化命運。進一步的單克隆分析發(fā)現(xiàn)，在同一轉(zhuǎn)錄組定義的祖細胞群內(nèi)，單個祖細胞具有不同的分化命運，并且在轉(zhuǎn)錄組水平上，不同分化命運的祖細胞仍存在微小的差異，提示同一祖細胞類群內(nèi)單個細胞的不同分化命運是預先確定的（圖H）。
CREST技術(shù)是一種高通量譜系示蹤的新方法，它不僅可以在單細胞水平解析體內(nèi)的發(fā)育譜系，而且可以在克隆水平解析發(fā)育過程中命運決定的分子機制，是目前已知的唯一可以對腦內(nèi)任意細胞群體進行高通量譜系示蹤的方法，為解析全腦發(fā)育譜系圖譜提供了關(guān)鍵技術(shù)。通過將CREST 小鼠與任意組織器官或特定類型細胞的Cre/CreER小鼠交配，CREST技術(shù)可以被廣泛地應(yīng)用于其他組織器官的發(fā)育譜系研究，并可以用于疾病、損傷或再生條件下的譜系研究。這為在單細胞和單克隆水平研究不同組織器官的發(fā)育和疾病發(fā)生提供了通用技術(shù)方法。
同時這一研究也證明，研究人員在體外分化得到的中腦多巴胺能神經(jīng)元不僅在基因表達，電生理特征，和環(huán)路整合特異性等方面和內(nèi)源多巴胺能神經(jīng)元相似（2021，Cell Stem Cell），其分化譜系也和內(nèi)源多巴胺能神經(jīng)元一致（2023，Cell Stem Cell；2023 Nature Methods （本研究）），為帕金森病細胞治療中中腦多巴胺能神經(jīng)細胞體外分化的準確性提供了理論依據(jù)。
該研究由中科院腦智卓越中心博士研究生謝連順與中科院營養(yǎng)健康所博士研究生劉恒心，在腦智卓越中心陳躍軍研究員和臨港實驗室魏武研究員的指導下完成。中科院腦智卓越中心游致文博士、王露悅博士、李依紋博士、博士研究生章馨月、何慧博士、職工袁停立、鄭文平博士，復旦大學兒科醫(yī)院研究生計筱珊，上海躍賽生物科技有限公司吳子彥博士，復旦大學腦科學研究院熊曼研究員，復旦大學周文浩教授，中科院腦智卓越中心蒲慕明院士為本研究提供了重要幫助。
陳躍軍，中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心，高級研究員。主要從事人多能干細胞的神經(jīng)分化和神經(jīng)退行性疾病的細胞治療，開發(fā)了能夠在體外和體內(nèi)進行高通量譜系示蹤的新技術(shù)SISBAR和CREST，解析了多巴胺能神經(jīng)分化的單細胞譜系，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了更安全有效的帕金森病細胞治療新策略；解析了帕金森病細胞治療中移植細胞環(huán)路整合和作用的新機制。研究成果以通訊作者（含共同）發(fā)表在Cell Stem Cell（4篇）, Nature Methods, Journal of Clinical Investigation, Brain等雜志。陳躍軍研究組長期招收干細胞生物學，神經(jīng)環(huán)路或發(fā)育神經(jīng)生物學背景的優(yōu)秀博士后，年薪30-45萬（根據(jù)發(fā)表的研究論文）。歡迎投遞簡歷至郵箱：yuejunchen@ion.ac.cn
文章鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41592-023-01947-3
參考文獻
Xie L, Liu H, You Z, et al. Comprehensive spatiotemporal mapping of single-cell lineages in developing mouse brain by CRISPR-based barcoding [published online ahead of print, 2023 Jul 17]. Nat Methods. 2023;10.1038/s41592-023-01947-3. doi:10.1038/s41592-023-01947-3
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