自閉癥(孤獨癥)譜系障礙(ASD)與大腦中豐富表達的基因有關(guān)，但我們尚不清楚這些基因是如何匯聚到特定細胞類型的網(wǎng)絡(luò)中。近日，kevin C.Eggan和Kasper Lageu團隊利用iPSC，在人類興奮性神經(jīng)元中的13個ASD相關(guān)基因中，構(gòu)建了它們的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。文章在最新一期的Cell Genomics雜志上發(fā)表，名為“Protein interaction studies in human induced neurons indicate convergent biology underlying autism spectrum disorders”。

ASD包括社交互動、認知和行為方面相關(guān)的可遺傳神經(jīng)發(fā)育癥狀。最近的進展表明，ASD 的不同表型反映了常見和罕見遺傳變異的多基因貢獻。然而，在神經(jīng)發(fā)育過程中，ASD的相關(guān)基因是如何整合到高級通路和網(wǎng)絡(luò)仍有待確定。
遺傳和生化數(shù)據(jù)表明，與復(fù)雜疾病有關(guān)的基因通常會匯聚到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (PPI) 網(wǎng)絡(luò)中。遺傳和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，ASD-相關(guān)基因在大腦中的特定神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞群中有著豐富的表達，其中興奮性神經(jīng)元是最強的信號之一。因此，從iPSC中衍生出的神經(jīng)元 (iNs)可以為研究 ASD提供一種關(guān)鍵的體外神經(jīng)元細胞模型。本文作者使用 iPSC 衍生出的興奮性 iNs、相互作用蛋白質(zhì)組學和計算方法，為ASD 相關(guān)的基因構(gòu)建腦細胞類型特定的 PPI 網(wǎng)絡(luò)。

ASD相關(guān)基因和蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)神經(jīng)元中表達

利用已有的24 個 ASD 相關(guān)基因為工作流程的起點，作者在 iNs 中生成 ASD PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖1A），本文將它們及其編碼的蛋白質(zhì)分別稱為索引基因（index genes）和索引蛋白質(zhì)（index proteins）。

作者在神經(jīng)元分化的第 0、3 和 6 周期間通過細胞 RNA 測序測量了 ASD 相關(guān)指標基因的表達（圖1C）。使用免疫印跡，作者評估了指標蛋白的表達。其中，只有 13 種蛋白質(zhì)，作者在分化的第 3 周檢測到。這些蛋白質(zhì)在物種、神經(jīng)元分化時間點或細胞類型中顯示出不同的模式（圖1E）。這些結(jié)果表明了，使用人類 iNs對了解 ASD 相關(guān)的細胞類型特異性的生化作用的重要性。

圖1.研究ASD相關(guān)基因和蛋白在人iNs中的表達及工作流程。

ASD指標蛋白在誘導(dǎo)神經(jīng)元中的相互作用蛋白質(zhì)組學

對于具有IP（immunoprecipitation）活性抗體的 13 種指標蛋白，作者在分化第 4 周在iN 中執(zhí)行 IP，然后進行質(zhì)譜分析 (IP-MS)（圖2A、2B）。

分析工作流程使用 SHANK3 的 IP 進行闡明。利用免疫印跡法， SHANK3 在 IP 中的富集（圖2A，左）得到證實，并通過 IP-MS 進行量化（圖2B）?？偟膩碚f，SHANK3 在免疫印跡和 MS 結(jié)果中出現(xiàn)富集，結(jié)合重復(fù)之間的相關(guān)性，支持作者數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和穩(wěn)健性。

PPI網(wǎng)絡(luò)由收斂的、新穎的和可重現(xiàn)的交互組成

作者合并了 26 個高質(zhì)量的 IP-MS 數(shù)據(jù)集以生成組合的 PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2C）。該網(wǎng)絡(luò)包含 13 種指標蛋白的 1,021 個相互作用因子，其中 >20% 與多個指標蛋白相關(guān)（圖2D）。根據(jù) STAR 方法，驗證了 71 個測試交互中的 65 個（圖2F，左）。在反向 IP 中，使用一組相互作用物作為誘餌，在 23 個具有誘餌富集的 IP 中檢測到 19 個中的原始指標蛋白（圖2F，右圖）。

PPI網(wǎng)絡(luò)概括了人腦中發(fā)生的相互作用

42% 的大腦交互被識別為 iNs 中的交互（圖2G）。作者還描述了 iN 衍生 PPI 網(wǎng)絡(luò)中相互作用蛋白的共表達模式（圖2H）。來自腦勻漿的 IP-MS 數(shù)據(jù)和大腦共表達分析表明，作者捕獲了在人腦復(fù)雜組織中發(fā)現(xiàn)的基因關(guān)系。

圖2. 為iNs中的13個ASD指標蛋白生成組合PPI網(wǎng)絡(luò)。

PPI 網(wǎng)絡(luò)涉及 ASD 中的第 2/3 層皮質(zhì)興奮性神經(jīng)元

為了評估 PPI 網(wǎng)絡(luò)的組織特異性，作者計算其與 GTEx 組織特異性基因與基因組其余部分的重疊富集。該網(wǎng)絡(luò)在CNS和其他幾個組織類別中顯示出顯著的富集（圖3A）。當重復(fù)大腦區(qū)域特異性基因時，該網(wǎng)絡(luò)在額葉皮層最豐富（圖3B）。該網(wǎng)絡(luò)在多種神經(jīng)元細胞類型中顯示出顯著富集（圖3C）。第 2/3 層興奮性神經(jīng)元作為唯一重要的細胞類型脫穎而出（圖3D）。

綜上所述，這些結(jié)果表明 PPI 網(wǎng)絡(luò)捕獲了 ASD 相關(guān)組織和細胞類型中的生化變化和通路，并特別暗示第 2/3 層興奮性神經(jīng)元是 ASD 中的關(guān)鍵細胞類型。

圖3. ASD PPI 網(wǎng)絡(luò)的組織和細胞類型富集

該網(wǎng)絡(luò)豐富了與 ASD 和發(fā)育障礙相關(guān)的罕見變體

作者評估了組合的 PPI 網(wǎng)絡(luò)和索引蛋白特異性子網(wǎng)絡(luò)是否豐富了與 ASD 相關(guān)的基因，結(jié)果表明，五個網(wǎng)絡(luò)在全局分析中達到顯著性，只有組合網(wǎng)絡(luò)在條件分析中具有顯著性。作者還使用發(fā)育障礙 (DDs) 和精神分裂癥 (SCZ) 和 gnomAD pLI 分數(shù)的外顯子組測序數(shù)據(jù)進行了類似的富集分析（圖4A）。

網(wǎng)絡(luò)分析可以優(yōu)先考慮來自遺傳研究的其他 ASD 相關(guān)基因

由于 PPI 網(wǎng)絡(luò)富集了與 ASD 相關(guān)的罕見變異，作者使用它來優(yōu)先考慮，在外顯子組測序研究中未達到嚴格統(tǒng)計顯著性的 ASD 相關(guān)基因。作者生成了一個“社會曼哈頓圖”以突出 PPI外顯子組測序數(shù)據(jù)中 FDR ≤ 0.25 的索引基因和其他 ASD 相關(guān)基因（圖4B）。

圖4.ASD PPI 網(wǎng)絡(luò)中的遺傳富集

結(jié) 論

到目前為止，很少有 PPI 研究利用神經(jīng)元細胞模型，更不用說將人類遺傳學作為指標基因選擇的切入點。作者構(gòu)建了一個由 13 種指標蛋白組成的 PPI 網(wǎng)絡(luò)，這些蛋白由人類 iPSC 衍生的興奮性神經(jīng)元中的高置信度 ASD 相關(guān)基因編碼。該網(wǎng)絡(luò)包含許多新的相互作用，豐富了在 ASD 個體中觀察到的遺傳和轉(zhuǎn)錄擾動，并可用于揭示與 ASD 相關(guān)的神經(jīng)元特異性生物學。該數(shù)據(jù)不僅能夠研究個體 ASD 相關(guān)基因的機制，而且還為治療干預(yù)或臨床分層策略提供了信息。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100250

編譯作者：Ayden（brainnews創(chuàng)作團隊）

校審：Simon（brainnews編輯部）

標簽：神經(jīng)科學腦科學