原代細(xì)胞（Primary cells）是指來源活體組織，經(jīng)過特定分離方法制備而成的初始細(xì)胞。

原代細(xì)胞離體時間短且不經(jīng)過永生化過程，其生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保持原有的遺傳特征，可更好地反映細(xì)胞在體內(nèi)的生長狀態(tài)，從而獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù)，很適合用于藥物測試、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)研究。

原代細(xì)胞培養(yǎng)技巧

1.?生長需求（Growth Requirements）

原代細(xì)胞可以懸浮培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)。一些細(xì)胞自然地懸浮在懸浮液中，而不附著在表面上（例如，來源于外周血的細(xì)胞）。也有一些細(xì)胞系經(jīng)過修飾可以在懸浮培養(yǎng)中存活，它們的生長密度高于粘附條件所允許的密度。對于依賴貼壁的原代細(xì)胞，貼壁細(xì)胞（例如實(shí)體組織）需要一個表面才能在體外正常生長。這些細(xì)胞大多在沒有涂層的扁平塑料容器中培養(yǎng)，但有時在微載體上培養(yǎng)，可以用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（如膠原蛋白和層粘連蛋白）包被，以增加粘附特性并提供生長和分化所需的其他信號。細(xì)胞培養(yǎng)基由補(bǔ)充了適當(dāng)?shù)纳L因子和細(xì)胞因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中生長，并維持在適當(dāng)?shù)臏囟群突旌蠚怏w中（對于哺乳動物細(xì)胞，通常為37°C，5％CO?）。培養(yǎng)條件根據(jù)細(xì)胞類型而廣泛變化，生長培養(yǎng)基的pH、葡萄糖濃度、生長因子和其他營養(yǎng)物質(zhì)的存在可能會有所不同，具體取決于細(xì)胞類型。

在建立原代培養(yǎng)過程中，必須在生長培養(yǎng)基中加入抗生素以抑制從宿主組織引入的污染?？股乜赡馨☉c大霉素，青霉素，鏈霉素和兩性霉素B的混合物。但是，不建議長期使用抗生素，因?yàn)槟承┰噭ɡ鐑尚悦顾谺）從長期來看可能對細(xì)胞有毒。

分離后保留原代細(xì)胞的活力非常重要，因?yàn)樗鼈冎械拇蠖鄶?shù)會經(jīng)歷衰老過程，并在一定數(shù)量的種群倍增后停止分裂。為了使細(xì)胞長期存活，必須具備出色的細(xì)胞培養(yǎng)操作技能以及適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件（即生長培養(yǎng)基、溫度、氣體混合物、pH、生長因子濃度、營養(yǎng)物質(zhì)和葡萄糖等）。用于補(bǔ)充培養(yǎng)基的生長因子通常來自動物血液（血液來源的成分具有污染的可能性），建議盡可能減少或消除這些成分的使用，操作時也需要使用無菌技術(shù)。

2. 細(xì)胞融合（Cellular confluence）

細(xì)胞融合通常是指附著的細(xì)胞在培養(yǎng)容器中所占的百分比。例如，100％的細(xì)胞融合意味著培養(yǎng)皿表面被細(xì)胞完全覆蓋，而50％的細(xì)胞融合意味著大約一半的表面被覆蓋。跟蹤和評估原代細(xì)胞培養(yǎng)是一個重要且必不可少的參數(shù)，因?yàn)楦鞣N細(xì)胞類型需要不同的融合終點(diǎn)，此時需要對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 繼代保持
（Maintenance and Subculture）

當(dāng)分離的細(xì)胞附著在培養(yǎng)皿表面時，細(xì)胞的維持階段開始。通常，培養(yǎng)開始后約需要24小時。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需的細(xì)胞融合百分比并活躍增殖時，就該進(jìn)行傳代培養(yǎng)了。這是在達(dá)到100％融合之前傳代原代細(xì)胞培養(yǎng)的最佳時間，因?yàn)槿诤虾蟮募?xì)胞可能會發(fā)生分化，并在傳代后顯示出較慢的增殖。依附依賴性細(xì)胞以單層生長，需要定期用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基傳代培養(yǎng)以維持指數(shù)生長。單層的繼代培養(yǎng)涉及細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)表面間鍵的斷裂，大多數(shù)粘附的原代細(xì)胞需要消化它們的蛋白質(zhì)附著鍵，或者需要用低濃度的蛋白水解酶（例如胰蛋白酶/ EDTA）從單層或相關(guān)組織中分離出來。細(xì)胞解離并分散成單細(xì)胞懸液后，將它們計數(shù)并稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，然后轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)容器中（培養(yǎng)基的組成取決于細(xì)胞類型而有所不同），在此處它們會重新附著并分裂。

4. 細(xì)胞計數(shù)（Cell counting）

血細(xì)胞計數(shù)器通常用于使用排阻染料錐蟲藍(lán)估計細(xì)胞數(shù)和確定細(xì)胞活力。血細(xì)胞計數(shù)器是相當(dāng)厚的玻璃顯微鏡載玻片，帶有矩形凹痕，可形成一個腔室。腔室上刻有垂直線的激光蝕刻柵格，并且精心制作了該設(shè)備。由線界定的面積和腔室的深度是已知的。因此，可以對特定體積的流體中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)，從而計算出整個流體中的細(xì)胞濃度。

5. 冷凍保存和恢復(fù)
（Cryopreservation and Recovery）

低溫保存是使用低溫保存結(jié)構(gòu)完整的活細(xì)胞的過程。冷凍保存和融化原代細(xì)胞是必不可少的，以最大程度地減少每個過程中的細(xì)胞損傷和死亡。對于原代細(xì)胞，可通過使用冷凍保護(hù)劑（例如DMSO或甘油，在正確的溫度和受控的冷凍速率下）實(shí)現(xiàn)。對于大多數(shù)原代細(xì)胞，可以在80％完全生長培養(yǎng)基的混合物中添加10％FBS和10％DMSO進(jìn)行冷凍保存。冷凍過程需要以每分鐘-1°C的速度緩慢進(jìn)行，以最大程度地減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。冷凍的培養(yǎng)物需要以液氮（-196°C）或低于-130°C的氣相存儲。解凍冷凍保存的細(xì)胞是快速的過程，方法是將冷凍的細(xì)胞浸入37°C水浴約1-2分鐘。注意不要在融化后離心原細(xì)胞（因?yàn)樗鼈儗鋬霰４婊謴?fù)過程中的損傷極為敏感）。最好在融化后直接鋪板細(xì)胞，并允許培養(yǎng)物在最初的24小時內(nèi)附著。當(dāng)啟動冷凍保存的原代細(xì)胞培養(yǎng)時，必須在細(xì)胞附著后去除用過的培養(yǎng)基（因?yàn)镈MSO對原代細(xì)胞，并可能導(dǎo)致解凍后活力下降）。

原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中可能存在的錯誤

污染：轉(zhuǎn)移主要組織進(jìn)行培養(yǎng)時需要注意避免污染。

pH值變化：這可能是由于培養(yǎng)基中的鹽分不正確，細(xì)菌或真菌污染，碳酸氫鹽緩沖液不足，二氧化碳張力不正確等引起的。

粘附性不足（細(xì)胞不貼壁）：培養(yǎng)基中不含附著因子（attachment factors）或附著因子不足，培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基污染，細(xì)胞被胰蛋白酶過度消化等。

生長緩慢：原因包括培養(yǎng)基的pH值變化，必需的促進(jìn)生長的成分/因子耗盡，低污染，試劑儲藏不當(dāng)?shù)取?br>

細(xì)胞死亡：溫度波動，二氧化碳含量過低，在融化和/或冷凍保存過程中細(xì)胞受損，有毒代謝產(chǎn)物濃度增加，培養(yǎng)基中的滲透壓失衡導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低。

沉淀（pH不變）：由于使用了冷凍培養(yǎng)基，在pH不變的培養(yǎng)基中可能會出現(xiàn)沉淀，殘留的磷酸鹽殘留在用洗滌劑洗滌時可能會沉淀出粉末狀的培養(yǎng)基成分。

細(xì)胞結(jié)塊（細(xì)胞不貼壁且結(jié)塊）：懸浮細(xì)胞可能由于鈣、鎂離子的存在（貫流時應(yīng)使用不含鈣、鎂離子的D-Hank’s緩沖液（D-HBSS），而不能選擇含有鈣、鎂離子的HBSS或可能含有鈣、鎂離子的PBS緩沖液）或細(xì)胞裂解及DNA釋放（過度用蛋白水解酶消化）而結(jié)塊。

誘導(dǎo)變異性：多種試劑和培養(yǎng)基會誘導(dǎo)原代細(xì)胞的數(shù)據(jù)產(chǎn)生變異，研究者的處理手法也可能導(dǎo)致原代細(xì)胞的數(shù)據(jù)產(chǎn)生變異。

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