●?標(biāo)題：
革蘭氏染色結(jié)果的影響因素及原因分析

●?作者：
陸東鋒，李金磊，高延玲，方忠意，董鵬，狄元冉，李紅嬋，吳志明

●?摘要：
為確定生鮮乳中單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速檢測方法，以從河南省奶站及奶牛養(yǎng)殖場抽取的267批生鮮乳為檢測對象，分別采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法、PCR檢測法和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法進(jìn)行檢測，并以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為參考標(biāo)準(zhǔn)，對檢測結(jié)果進(jìn)行比對確認(rèn)。結(jié)果顯示：常規(guī)的傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢出陽性3份；PCR法檢出陽性5份，經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法確認(rèn)陽性3份，符合率為60%；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法檢出陽性3份，經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法全部確認(rèn)為陽性，符合率為100%。結(jié)果表明，同傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，PCR法容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，而基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法能夠快速、準(zhǔn)確檢測生鮮乳中單核細(xì)胞增生李斯特菌，適合于大批量樣品的快速檢測。

●?關(guān)鍵詞：
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 生鮮乳 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 PCR檢測 分離鑒定

●?全文內(nèi)容：

李斯特菌屬（Listeria）是一類革蘭氏陽性兼性厭氧菌，共有7個種，分別為單核細(xì)胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）、伊氏（綿羊）李斯特菌（L. ivanovii）、英諾克（無害）李斯特菌（L. innocua）、威氏李斯特菌（L. welshimei）、斯氏李斯特菌（L. seeligeri）、格氏李斯特菌（L. grayi）和默氏李斯特菌（L. murrayi），其中只有單核細(xì)胞增生李斯特菌是人獸共患病原菌。

單核細(xì)胞增生李斯特菌在自然界分布廣泛，可存在于養(yǎng)殖、種植、加工、貯藏和流通的全過程，能引起人和動物的流產(chǎn)、腦炎、腦膜炎和敗血癥等，致死率高，嚴(yán)重威脅人和動物健康。2011年8—9月美國有72人感染單核細(xì)胞增生李斯特菌，其中13人死亡；據(jù)南非《目擊者新聞》2018年1月8日報道，自2017年年初李斯特菌病暴發(fā)以來，南非共有727人感染，其中61人死亡。

健康奶牛是單核細(xì)胞增生李斯特菌的自然宿主。生鮮乳營養(yǎng)豐富，是微生物生長的良好基質(zhì)。單核細(xì)胞增生李斯特菌能隨生鮮乳一道分泌，在冷藏條件下仍能生長，因此冷藏生鮮乳存在較大污染風(fēng)險。鑒于此，對生鮮乳中單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速檢測極為重要。本研究以從河南省奶站及奶牛養(yǎng)殖場抽取的生鮮乳為檢測對象，分別采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法、PCR法和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法（MALDI-TOF MS）進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測，并以傳統(tǒng)方法為金標(biāo)準(zhǔn)，對檢測結(jié)果進(jìn)行比較，確定生鮮乳中最適宜的單核細(xì)胞增生李斯特菌快速檢測方法，從而為生鮮乳風(fēng)險評估及生產(chǎn)實踐提供技術(shù)支持。

? ?材料與方法??

材料

樣品來源。2019年1—8月，抽取河南省奶站及奶牛養(yǎng)殖場生鮮乳共計267批。

菌株。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 19111，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

方法

傳統(tǒng)培養(yǎng)法

增菌。取1mL生鮮乳樣品加入到9mL滅菌LB1的無菌離心管內(nèi)，在振蕩器上連續(xù)震蕩2min混勻，（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h；移取0.1 mL，加入到10mL的LB2增菌液內(nèi)，（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h。

分離。取PCR篩選陽性LB2增菌培養(yǎng)物，劃線接種于PALCAM選擇平板和李斯特菌顯色平板，（36±1）℃培養(yǎng)24~48h。待單核細(xì)胞增生李斯特菌在PALCAM培養(yǎng)基上長出小圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈或有黑色凹陷時，選擇單個可疑菌落劃線接種于TSA-YE平板，（36±1）℃培養(yǎng)18~24h。

動力試驗。挑取TSA-YE上純培養(yǎng)的單個菌落，穿刺SIM動力培養(yǎng)基，25~30℃培養(yǎng)48h，觀察培養(yǎng)結(jié)果，若不明顯可繼續(xù)培養(yǎng)至5d再觀察結(jié)果。如果單核細(xì)胞增生李斯特菌有動力，則在SIM培養(yǎng)基上呈傘狀生長。

生化鑒定。從TSA-YE上挑取適當(dāng)菌落，于接種液中調(diào)制菌液濃度至0.5MCF，然后添加到革蘭氏陽性細(xì)菌藥敏板，采用全自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

溶血試驗。挑取TSA-YE上純培養(yǎng)單個菌落，穿刺接種到哥倫比亞血瓊脂平板，穿刺時應(yīng)盡量接近底部，但不要觸到底面，（36±1）℃培養(yǎng)24~48h，于明亮處觀察結(jié)果。如果是單核細(xì)胞增生李斯特菌，則呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血環(huán)。

PCR檢測

增菌。方法同上。

DNA提取。取LB2增菌培養(yǎng)物1 mL于離心管中，離心棄上清，用1mL無菌去離子水懸浮離心10min；棄上清，再用0.2mL無菌去離子水懸浮，100℃煮沸20 min，-20℃冷凍30min；室溫下，待菌液完全融化后高速離心2min，收集上清液即可用于PCR擴增。

PCR擴增以及電泳檢測。對檢測陽性樣品，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行確認(rèn)。

MALDI-TOF MS檢測

增菌和分離。樣品的增菌和分離分別同上。

樣品制備。向1.5mL離心管中加入1mL 75%的無水乙醇，從TSA-YE平板上挑取4~6個菌落于離心管中，震蕩混勻，超聲3min，12000 r/min高速離心2 min，棄去上清；加入50μL 70%甲酸、50μL乙腈，震蕩混勻，超聲3min，12 000r/min高速離心2min，收集上清液。

點樣。用移液槍取1μL上清液，點涂于MALDI靶板孔上，自然晾干；再取1μL CHCA基質(zhì)（50%CAN、50%H2O、1%TFA）覆蓋到樣品上，自然晾干，然后將靶板放入質(zhì)譜儀內(nèi)進(jìn)行測量。

質(zhì)譜分析。設(shè)定質(zhì)譜條件，采集一級質(zhì)譜圖。利用Shimadzu Biotech launchpad軟件，對采集到的數(shù)據(jù)圖譜進(jìn)行分析鑒定。將采集結(jié)果導(dǎo)入Mascot數(shù)據(jù)庫中，與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對，經(jīng)過軟件計算，給出得分和鑒定結(jié)果。對檢測陽性樣品，同樣采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行確認(rèn)。

? ?結(jié)果與分析??

傳統(tǒng)培養(yǎng)法

經(jīng)李氏增菌肉湯（LB1、LB2）選擇性增菌、PALCAM和李斯特菌顯色平板選擇性分離，以及動力試驗、溶血試驗、全自動生化鑒定系統(tǒng)鑒定，共確定單核細(xì)胞增生李斯特菌陽性樣品3份。單核細(xì)胞增生李斯特菌在PALCAM平板上菌落形態(tài)見圖1。

PCR檢測

對267個樣品進(jìn)行二次選擇性增菌培養(yǎng)、PCR檢測，共檢出疑似陽性樣品5份，經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法確認(rèn)陽性3份，符合率為60%。部分PCR檢測結(jié)果見圖2。

MALDI-TOF MS檢測

經(jīng)李氏增菌肉湯（LB1、LB2）選擇性增菌、PALCAM和李斯特氏菌顯色平板選擇性分離以及MALDI-TOF MS鑒定，共確定單核細(xì)胞增生李斯特菌陽性樣品3份，并經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法確認(rèn)全部為陽性，符合率為100%。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MALDI-TOF MS飛行時間質(zhì)譜鑒定結(jié)果圖3略。

? ?討 論??

單核細(xì)胞增生李斯特菌感染中，絕大多數(shù)為食源性感染。而在一些單核細(xì)胞增生李斯特菌散發(fā)感染病例研究中發(fā)現(xiàn)，50%以上的病例與生鮮乳及其乳制品有關(guān)。目前，國內(nèi)生鮮乳中單核細(xì)胞增生李斯特菌監(jiān)測還未廣泛開展，但由于其導(dǎo)致的病死率極高，因此為保證公共衛(wèi)生安全，對生鮮乳中單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速、準(zhǔn)確檢測十分重要。

準(zhǔn)確的單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測仍然是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，但其操作繁瑣、工作量大，檢測周期長，難以滿足大批量樣品檢測的需求。PCR檢測法具有快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，但易造成污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果產(chǎn)生。MALDI-TOF ? MS飛行間質(zhì)譜檢測法，具有高通量、快速、準(zhǔn)確等特點，能夠大大縮短工作時間，減少工作量，因而可以極大提高檢測的準(zhǔn)確率和工作效率。

本研究中，PCR檢測法檢出陽性樣品5份，最終確定陽性3份。分析原因可能是，PCR檢測的是基因，并不能有效區(qū)分活菌和死菌，容易受樣品中核酸的干擾，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。MALDI-TOF MS飛行間質(zhì)譜法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法符合率為100%，檢測結(jié)果較PCR方法準(zhǔn)確。

孟慶玲等對新疆石河子地區(qū)249份動物性食品進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測，發(fā)現(xiàn)平均陽性率為4.8%；陳慧中等對2012—2014年沈陽市509份食品進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測，發(fā)現(xiàn)檢出率為5.1%；吳玲玲等對2015—2017年河南省預(yù)包裝熟肉制品生產(chǎn)加工過程的430份樣品進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測，發(fā)現(xiàn)檢出率為17.0%；時煒等對成都市某乳牛場125份環(huán)境樣本和原奶樣本進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測，發(fā)現(xiàn)檢出率為2.4%；靳曉燕等對22份奶及奶制品進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測，發(fā)現(xiàn)檢出率為4.5%。本研究的生鮮乳中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢出率為1.1%（3/267），相對于上述食品及其他研究，檢出率較低。這可能與不同地區(qū)、不同樣品來源、不同生產(chǎn)環(huán)境的單核細(xì)胞增生李斯特菌污染存在差異有關(guān)。

牛場衛(wèi)生水平差是生鮮乳中單增李斯特菌污染的首要因素。劣質(zhì)的青貯料、奶牛飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生差、奶牛場清洗消毒不到位以及飼養(yǎng)員個人衛(wèi)生差等都能導(dǎo)致生鮮乳中單核細(xì)胞增生李斯特菌的污染，因此飼喂優(yōu)質(zhì)的青貯料、保證擠奶過程和奶廳的衛(wèi)生條件是避免生鮮乳中單核細(xì)胞增生李斯特菌污染的重要途徑。但由于目前我國對生鮮乳中單核細(xì)胞增生李斯特菌的相關(guān)報道還不夠全面，以后需加強對這方面的調(diào)查研究。

? ?結(jié) 論??

研究發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF ? MS飛行間質(zhì)譜法相比PCR法，對生鮮乳中的單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢出準(zhǔn)確率高，而較傳統(tǒng)培養(yǎng)法，又具有高通量、快速等優(yōu)點，因而能夠大大縮短工作時間，減少工作量，適合用于目前大批量生鮮乳樣品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速檢測。

原文：
https://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CJFQ&dbname=CJFDAUTO&filename=ZGDW202002021&v=MTcyMjlOSE1yWTlIWllSOGVYMUx1eFlTN0RoMVQzcVRyV00xRnJDVVI3cWZaT2R2RkN2bFVMM1BQeXJQZWJHNEg=

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