生物污染簡(jiǎn)介

細(xì)胞培養(yǎng)物污染往往是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中最常見的問(wèn)題，有時(shí)會(huì)造成非常嚴(yán)重的后果。細(xì)胞培養(yǎng)污染物可分為兩大類，一類是化學(xué)污染物，如培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)，包括內(nèi)毒素、增塑劑和洗滌劑，另一類是生物污染物，如細(xì)菌、霉菌、酵母、病毒和支原體，以及其他細(xì)胞系的交叉污染。雖然污染無(wú)法完全消除，但可以通過(guò)全面了解其來(lái)源并遵循良好的無(wú)菌技術(shù)來(lái)降低污染的發(fā)生頻率和嚴(yán)重性。這里將概述主要的生物污染類型。

01?細(xì)菌

細(xì)菌是一大類普遍存在的單細(xì)胞微生物。細(xì)菌的直徑通常只有幾微米，其形狀多樣，如球狀、桿狀和螺旋狀等。由于分布廣泛、生長(zhǎng)迅速和體積大小等特點(diǎn)，細(xì)菌以及酵母和霉菌是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的生物污染物。細(xì)菌污染在培養(yǎng)物感染后幾天內(nèi)就很容易被肉眼觀察到；受感染的培養(yǎng)物通常會(huì)變得渾濁，有時(shí)表面會(huì)有一層薄膜。經(jīng)常還會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值突然下降的情況。在低倍顯微鏡下，細(xì)菌以細(xì)小顆粒的形式出現(xiàn)在細(xì)胞之間，在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出單個(gè)細(xì)菌的形狀。下面的模擬圖像顯示了貼壁培養(yǎng)的293細(xì)胞被大腸桿菌污染。

02?酵母

酵母是真菌界中的單細(xì)胞真核微生物，大小從幾微米（常見）到40μm（罕見）不等。與細(xì)菌污染一樣，被酵母污染的培養(yǎng)物會(huì)變得混濁，尤其是在污染的后期。被酵母污染的培養(yǎng)物，其pH值幾乎沒有變化，通常直到污染嚴(yán)重時(shí)，pH值才會(huì)升高。在顯微鏡下，酵母呈單個(gè)卵球形或球形顆粒，可能還會(huì)出芽產(chǎn)生更小的顆粒。下面的模擬圖像顯示了貼壁293細(xì)胞鋪板24小時(shí)后被酵母感染的情況。

03 黑膠蟲

黑膠蟲是一種生物還是非生物，學(xué)術(shù)界至今還有爭(zhēng)議。這里我們暫且將其認(rèn)作是一種微生物。黑膠蟲污染主要來(lái)源于血清。黑膠蟲的出現(xiàn)常在培養(yǎng)條件改變、細(xì)胞接種密度降低、細(xì)胞狀態(tài)不佳時(shí)顯現(xiàn)并使實(shí)驗(yàn)中斷，尤其在凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)可造成大量細(xì)胞死亡。黑膠蟲生長(zhǎng)與細(xì)胞的生長(zhǎng)有此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，即當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)好時(shí)小黑點(diǎn)會(huì)相應(yīng)的減少；反之則增加，似乎有細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)的關(guān)系。

黑膠蟲污染的特點(diǎn)是起初對(duì)細(xì)胞并無(wú)影響，當(dāng)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)則會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。受黑膠蟲污染的細(xì)胞液通常清亮無(wú)變化，在高倍顯微鏡下可以觀察到點(diǎn)狀片狀的游動(dòng)小體，做布朗運(yùn)動(dòng)。

04?支原體

支原體是最小的（0.3?μm）能夠自我復(fù)制的有機(jī)體，倒置顯微鏡下通常觀察不到。支原體沒有細(xì)胞壁，對(duì)常用的抗生素不敏感。支原體感染是極為不易察覺的，可能直到出現(xiàn)了可以觀察到的病變或發(fā)現(xiàn)細(xì)胞正常功能喪失的時(shí)候，才意識(shí)到是發(fā)生了支原體感染。一些生長(zhǎng)緩慢的支原體可在培養(yǎng)物中持續(xù)存活，而不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但它們可以改變培養(yǎng)體系中宿主細(xì)胞的行為和代謝。慢性支原體感染的可能表現(xiàn)包括：細(xì)胞增殖率降低、飽和密度下降以及懸浮培養(yǎng)物凝集；但是，檢測(cè)支原體污染的唯一可靠方法是通過(guò)使用熒光染色（例如Hoechst33258染色）、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或微生物測(cè)定法定期檢測(cè)培養(yǎng)物。

05?霉菌

霉菌是真菌界的真核微生物，以多細(xì)胞絲狀體生長(zhǎng)，稱為菌絲。這些多細(xì)胞絲狀體構(gòu)成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)含有遺傳性相同的細(xì)胞核，被稱為集落或菌絲體。與酵母污染相似，培養(yǎng)物的pH值在污染的初期保持穩(wěn)定，然后隨著培養(yǎng)物感染程度加劇而迅速增加，并變得渾濁。在顯微鏡下，菌絲體通常呈細(xì)長(zhǎng)的絲狀體，有時(shí)呈密集的孢子團(tuán)。許多種霉菌的孢子在休眠階段能夠耐受極其惡劣和不宜生長(zhǎng)的環(huán)境，當(dāng)其遇到合適的生長(zhǎng)條件時(shí)才會(huì)被激活。

06 病毒

病毒是一種微小的感染性病原體，利用宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)行繁殖。它們的體積極小，難以在培養(yǎng)中被檢測(cè)到，也難以從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室使用的試劑中去除。由于大多數(shù)病毒對(duì)宿主有非常嚴(yán)格的要求，因此，它們通常不會(huì)對(duì)宿主以外物種的細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生不良影響。但被病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員造成嚴(yán)重的健康威脅，尤其是當(dāng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的是人類或靈長(zhǎng)類的細(xì)胞時(shí)。要檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物是否被病毒感染，可以使用電子顯微鏡觀察、用抗體組合進(jìn)行免疫染色、ELISA檢測(cè)或是使用合適的病毒引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

07 交叉污染

雖然不如微生物污染普遍，但許多細(xì)胞系與HeLa以及其他快速生長(zhǎng)細(xì)胞系之間的廣泛交叉污染已經(jīng)是一個(gè)明確的問(wèn)題，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。從值得信賴的細(xì)胞庫(kù)中獲取細(xì)胞系，定期檢查細(xì)胞系的特性，并使用良好的無(wú)菌技術(shù)進(jìn)行操作，這些做法都將幫助您避免交叉污染。DNA指紋圖譜分析、核型分析和細(xì)胞亞型分析可以確定細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在交叉污染。

08 使用抗生素

請(qǐng)勿在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中使用抗生素，因?yàn)榭股氐倪B續(xù)使用會(huì)促進(jìn)耐藥菌株的生長(zhǎng)，并導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除，就會(huì)發(fā)展成大規(guī)模污染?？股氐某掷m(xù)使用還可能掩蓋支原體感染和其他隱性污染。此外，某些抗生素可能會(huì)與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)，干擾正在研究的細(xì)胞過(guò)程?？股刂荒茏鳛閷?duì)付污染的最后手段且只能短期使用，并應(yīng)盡快從培養(yǎng)物中去除。如果長(zhǎng)期使用抗生素，則應(yīng)同時(shí)進(jìn)行無(wú)抗生素培養(yǎng)，作為檢測(cè)隱性感染的對(duì)照。

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