前面幾期，小編對(duì)慢病毒感染細(xì)胞的全流程進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本期內(nèi)容小編與大家分享單克隆細(xì)胞株構(gòu)建方式。什么是單克隆細(xì)胞株呢？我們一般將感染后經(jīng)過(guò)篩選的細(xì)胞稱為穩(wěn)轉(zhuǎn)株，也就是混合克隆細(xì)胞株?；旌峡寺〖?xì)胞株雖然可以表達(dá)目的片段，但不同克?。?xì)胞）的目的基因整合位置和表達(dá)量均有所不同。另外由于不同細(xì)胞克隆的增殖速度不同：陰性細(xì)胞＞目的基因表達(dá)量較低的陽(yáng)性細(xì)胞＞表達(dá)量較高的陽(yáng)性細(xì)胞。因此一般在混合克隆細(xì)胞株傳代的10代左右會(huì)觀察到表達(dá)量逐漸下降，最后高表達(dá)量的細(xì)胞消失，得到由低/中等表達(dá)量的細(xì)胞組成的混合克隆細(xì)胞株。而單克隆細(xì)胞株是從混合克隆細(xì)胞中經(jīng)單個(gè)細(xì)胞增殖所得，即由同一個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增得到的細(xì)胞株。每個(gè)細(xì)胞的目的基因整合位置以及表達(dá)量等特征均高度一致。

一般情況下，混合克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株即可滿足科研需求，比如基因功能初步驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)，節(jié)省了單克隆化的時(shí)間與經(jīng)濟(jì)成本。但與單克隆株相比，以此得出的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性與重復(fù)性往往稍差，若想減少實(shí)驗(yàn)的波動(dòng)，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，則需要挑選單克隆細(xì)胞株。

構(gòu)建單克隆細(xì)胞株前需要預(yù)先對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估，主要為兩個(gè)方面：1、細(xì)胞類型，構(gòu)建過(guò)程至少需要實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖10代以上，最好選擇商品化的細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。2、細(xì)胞克隆形成率，指細(xì)胞在極低密度條件下的生長(zhǎng)能力，一般細(xì)胞克隆形成率＞10%的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞有較大可能獲得單克隆。

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實(shí)驗(yàn)室常用的單克隆細(xì)胞株挑選方式有三種：

一、有限稀釋法，采用梯度稀釋原則，將細(xì)胞懸液連續(xù)倍數(shù)稀釋至極低密度，接種于96孔板，直至孔中出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞克隆。簡(jiǎn)單易操作，但整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程比較耗時(shí)。具體步驟如下：

l單細(xì)胞懸液制備：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液；

l細(xì)胞計(jì)數(shù)：取少量細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色后對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；

l細(xì)胞梯度稀釋：將細(xì)胞懸液移至刻度離心管中連續(xù)倍數(shù)稀釋，稀釋至5～10個(gè)細(xì)胞/mL；

l細(xì)胞接種：將稀釋好的細(xì)胞懸液分別接種于96孔板中，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

l單克隆標(biāo)記：細(xì)胞貼壁后，在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔的細(xì)胞數(shù)，標(biāo)記只含一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞孔，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)期間，視培養(yǎng)液pH值的變化決定是否更換培養(yǎng)液；

l擴(kuò)大培養(yǎng)：待單細(xì)胞群落生長(zhǎng)至孔底面積的1/3或1/2時(shí)，將細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。

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二、平皿克隆分離法，通過(guò)在平皿內(nèi)預(yù)置小蓋玻片或用金屬套環(huán)并加消化液達(dá)到分離克隆細(xì)胞的目的。

l單細(xì)胞懸液制備：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液；

l細(xì)胞計(jì)數(shù)：取細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色后對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；

l細(xì)胞梯度稀釋：通過(guò)稀釋將細(xì)胞密度調(diào)整至每5ml培養(yǎng)液含50-250個(gè)細(xì)胞；

l克隆化培養(yǎng)：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入直徑60mm的平皿內(nèi)，培養(yǎng)8-15天；

l分離克隆與擴(kuò)大培養(yǎng)：套環(huán)法，鏡下觀察克隆形成情況，標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞克隆→移去培養(yǎng)液，用無(wú)菌鑷子取金屬套環(huán)并在一端涂少量無(wú)菌硅脂→利用金屬套環(huán)圈住一個(gè)單克隆細(xì)胞群落，并在其中加入少量胰酶→將消化的單克隆細(xì)胞群落轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)皿中（24或6孔板），擴(kuò)大培養(yǎng)。玻片法，接種細(xì)胞前在直徑為60nm的平皿中預(yù)先分散放置一定數(shù)量的無(wú)菌小玻片→入細(xì)胞懸液，隔天觀察并標(biāo)記只含一個(gè)細(xì)胞的玻片→培養(yǎng)一段時(shí)間后，用無(wú)菌鑷子夾出長(zhǎng)成單克隆細(xì)胞群落的玻片并轉(zhuǎn)移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。

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三、軟瓊脂克隆分離法，適用于懸浮細(xì)胞。

l接種：將稀釋好的單細(xì)胞懸液接種至鋪有軟瓊脂的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；

l觀察：鏡下觀察單克隆細(xì)胞群落出現(xiàn)的情況；

l擴(kuò)大培養(yǎng)：鏡下用毛細(xì)吸管吸取單個(gè)細(xì)胞克隆群落，移入小試管中吹打，使細(xì)胞從瓊脂中釋放。將含克隆細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至合適的培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)。

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實(shí)驗(yàn)室常用的單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建方式分享到此結(jié)束，供大家參考。漢恒專營(yíng)工具病毒十余載，如有病毒需求或有相關(guān)問(wèn)題歡迎隨時(shí)咨詢。