NK細胞

自然殺傷細胞（Natural killer cell，NK細胞?)，是除T細胞、B細胞之外的第三大類淋巴細胞，不表達T細胞和B細胞所特有的膜表面分子。無需抗原的預先刺激與活化即可直接殺傷被病毒感染的自身細胞或腫瘤細胞，與抗腫瘤、抗感染和免疫調節(jié)有關，是固有免疫最重要的組成成分之一。

NK細胞大概約占外周血淋巴細胞的10％—15％，主要源于骨髓中的造血干細胞，由NK前體細胞發(fā)育分化而來，是腫瘤免疫微環(huán)境中的重要效應細胞。人NK細胞可根據(jù)其表面標志物CD56的表達分為兩類：CD56dim和CD56bright，其中CD56dimNK細胞主要存在于外周血中，可表達顆粒酶、穿孔素直接殺傷腫瘤細胞，CD56brightNK細胞主要存在于淋巴器官中，不表達穿孔素，產(chǎn)生大量的細胞因子，如γ干擾素，腫瘤壞死因子α，IL-12、IL-15和IL-18，具有重要的免疫調節(jié)功能。NK細胞是抗體依賴細胞介導的細胞毒作用（ADCC）的主要效應細胞，對清除腫瘤細胞、控制細菌和病毒感染具有重要作用。

用于腫瘤免疫治療的NK細胞策略有：體外活化的自體或異體NK細胞治療；聯(lián)合NK細胞和單抗藥（如免疫檢查點抑制劑）來誘導抗體特異的細胞毒性；構建CAR-NK細胞免疫療法等，這種細胞療法的治療關鍵，在于產(chǎn)生數(shù)量足夠的、能夠識別并殺傷腫瘤的免疫細胞以及效應細胞。它們在到達腫瘤所在的部位后能夠被激活，發(fā)揮抗腫瘤的作用；除此之外，還可以替代修補或者改善化療所引起的免疫功能受損。

目前體外NK培養(yǎng)技術目前已經(jīng)很成熟，針對于我司的NK細胞培養(yǎng)試劑盒，現(xiàn)歸納整理了試劑盒使用注意事項及攻略，方便老師們在NK培養(yǎng)時查閱。

首先在開始實驗之前，我們要確認一下所需物料是否充足、設備是否都正常運行，如果均正常的話就可以進行接下來的試驗了，在這里小編整理了一些關于NK細胞培養(yǎng)的攻略，主要涉及到物料的使用及操作方法等。

01、培養(yǎng)基的使用

① 每次補液前需要將培養(yǎng)基在室溫下自然復溫。

② 禁止將整瓶培養(yǎng)基放入37℃孵箱復溫，否則會加速補液培養(yǎng)基中細胞因子的失活。

③?配置好的擴增培養(yǎng)基（含IL-2）時效較短，超過一周不建議使用，尤其是活化前期（前7天）。

02、正確處理和保存血漿：具體見說明書。滅活離心后的血漿要確保澄清，添加血漿時需考慮抗凝劑對血漿的稀釋作用。

03、培養(yǎng)袋的使用：培養(yǎng)體積小于1L的時候，需要折疊培養(yǎng)袋再進行放置。建議使用我司推薦型號。

04、靈活掌握補液時機：細胞擴增狀態(tài)不理想時，前期補液可推遲補液時間，不要調整補液的體積尤其注意第一次補液的時機。裝袋后的補液體積和補液時間可根據(jù)細胞狀態(tài)進行調整。

05、控制細胞結團：細胞裝袋前，需要根據(jù)克隆團的情況充分拍散細胞。裝袋后也需每天對袋子進行拍打，揉搓肉眼觀察較大的細胞團。

06、培養(yǎng)初期不要隨意晃動培養(yǎng)瓶：否則活化的克隆團容易飄起來，而降低包被因子對細胞團的活化。

07、分離PBMC:推薦用進口淋巴細胞分離液

①最高的得率和細胞活性

②減少血小板和細胞碎片的殘留（太多影響NK細胞貼壁，進而影響活化）

③種瓶密度：PBMC鋪瓶的起始細胞密度建議2×10?個/mL，臍血初始NK比例較低時，可適當提高初始鋪瓶細胞密度至3-4×10?個/mL。

08、細胞鋪瓶（推薦用電動移液器打到非包被接觸的瓶底）

①分離的PBMC用生理鹽水洗滌2次重懸于25ml培養(yǎng)基（保證細胞分散）

②電動移液器打到非包被接觸的瓶底，輕輕擺動瓶子鋪勻即可，時間盡量短

09、設備保養(yǎng)：定期檢查CO2培養(yǎng)箱溫度、濃度并及時更換濾網(wǎng)。定期保養(yǎng)和清潔生物安全柜。

10、環(huán)境監(jiān)測：定期更換初效、中效、高效過濾器，保證潔凈區(qū)環(huán)境標準。

11、固定實驗耗材種類和型號：需提前評估變更型號、規(guī)格對培養(yǎng)效果的影響，如175的培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)袋。

同立海源AMMS?NK細胞培養(yǎng)試劑盒套裝組分均采用公司自產(chǎn)的GMP級細胞因子制備，并采用進口藥用包材在GMP制藥環(huán)境生產(chǎn)，適用于自體外周血或臍血細胞中分離得到的單個核細胞體外擴增培養(yǎng)。另外該試劑盒已通過美國FDA 的 DMF II類備案（035588），不僅滿足客戶對高純度、高活率的NK細胞需求，并且滿足CAR-NK細胞藥物臨床實驗要求。

——NK、CAR-NK細胞藥物臨床實驗最佳選擇！

NK總細胞擴增變化

NK細胞擴增比例

PBMC培養(yǎng)流式結果

關于同立海源

北京同立海源生物科技有限公司，成立于2011年，專注細胞和基因治療（CGT）上游GMP級原料試劑研發(fā)，致力于為生命科學提供可靠的產(chǎn)品與服務。產(chǎn)品涉及細胞分選磁珠試劑，真核/原核重組蛋白、無血清培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)試劑盒、轉染試劑、基因編輯工具酶等。為細胞和基因治療藥物、抗體藥物開發(fā)、細胞儲存等生物制藥和IVD領域提供核心原料試劑與服務。

北京同立海源生物科技有限公司的全資子公司北京景達醫(yī)療器械有限公司建有2000㎡的研發(fā)實驗室及GMP級潔凈車間，包括真核與原核蛋白表達工程平臺、細胞培養(yǎng)技術開發(fā)平臺、體外診斷試劑生產(chǎn)平臺，通過ISO13485和ISO9001雙認證，部分產(chǎn)品已獲美國FDA DMF備案。