2022年5月20日，四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿科李虹、羅德毅教授團(tuán)隊在?Signal Transduction and Targeted Therapy?（IF：18.19）雜志上發(fā)表了題名為“Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis”的研究論文。文中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與 10x 空間轉(zhuǎn)錄組由博奧晶典提供技術(shù)服務(wù)。

該研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、10x 空間組學(xué)和質(zhì)譜流式（CyTOF）技術(shù)對間質(zhì)性膀胱炎（IC）的免疫微環(huán)境進(jìn)行深入研究，文章刻畫了 IC 患者的膀胱免疫圖譜，探索了免疫細(xì)胞的亞群特征、分布及相互作用關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿路上皮細(xì)胞在 IC 的病理生理機制和疾病進(jìn)展中可能發(fā)揮著重要作用，并且尿路上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞可能協(xié)調(diào) IC 膀胱中免疫細(xì)胞的激活、歸巢和相互作用，然而異常激活的免疫細(xì)胞和部分效應(yīng)細(xì)胞的功能喪失導(dǎo)致膀胱免疫微環(huán)境失衡、膀胱功能障礙及解剖結(jié)構(gòu)的破壞，致使患者出現(xiàn)下尿路癥狀及膀胱纖維化的轉(zhuǎn)歸。同時，文章發(fā)現(xiàn)了一些具有潛在診斷功能的尿液標(biāo)志物，如 IgE 和 CCL5。本文為 IC 的基礎(chǔ)研究和診斷治療提供了豐富的科學(xué)線索和理論依據(jù)。

科學(xué)問題

間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征（IC/BPS）是目前婦科泌尿領(lǐng)域最為棘手的一種疾病，主要的臨床表現(xiàn)為尿頻和充溢性膀胱劇烈疼痛。臨床常用的治療方案在長期的隨訪中效果均不佳，約 10% 的患者最終會因為無法忍受該疾病帶來的痛苦和精神壓力，選擇膀胱全切。該疾病的存在已有超過 100 年歷史，但至今病因不明，近年來免疫學(xué)說在 IC 的發(fā)病機制中備受關(guān)注，但免疫在 IC 發(fā)生發(fā)展過程中扮演著什么樣的角色以及具體在 IC 進(jìn)程的哪個階段發(fā)揮效應(yīng)作用并不清楚。
目前對于 IC 免疫微環(huán)境的研究主要通過病理切片染色、流式細(xì)胞學(xué)以及 Bulk RNA 測序等技術(shù)對膀胱組織、血液、和尿液進(jìn)行初步分析，它們在多大程度上能反映 IC 炎癥情況、細(xì)胞亞群、分布和狀態(tài)尚不清楚。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1、IC 膀胱免疫圖譜

從 IC 患者和對照者膀胱中捕獲 135091 個CD45+?免疫細(xì)胞，數(shù)據(jù)質(zhì)控后保留 92029 個高質(zhì)量免疫細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。通過經(jīng)典 marker genes 鑒定分群并構(gòu)建 IC 免疫圖譜。圖譜中共有 22 種免疫細(xì)胞類型，其中發(fā)現(xiàn)的 pDC、USMB、TBC、效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞等細(xì)胞類型進(jìn)一步完善了 IC 膀胱免疫亞群的豐富度（圖1 a-h）。

2、CD8+?T 細(xì)胞功能障礙和 B 細(xì)胞的異常活化
T 細(xì)胞的再聚類共鑒定出 9 個 T 細(xì)胞亞群（圖2 a-b）。細(xì)胞比例分析可見 IC 膀胱中 Tregs 細(xì)胞的增加以及 Th17 細(xì)胞的減少（圖2 c）。與對照組相比，IC 中 Tregs 的差異基因主要富集在 mRNA 分解代謝、病毒受體和局灶黏附過程（圖2 d）。而 Th17 細(xì)胞的差異基因主要富集于經(jīng)典炎癥信號通路（圖2 e）。重要的是，IC 組 CD8+?T 細(xì)胞可見耗竭基因高表達(dá)，表明其效性功能受損，病原體清除能力降低（圖2 f、g）。
B 細(xì)胞再聚類鑒定出 6 個亞群（圖2 h-i），IC 膀胱中活化 B 細(xì)胞 Act B 和非轉(zhuǎn)換記憶 B 細(xì)胞 USMB 顯著增加，轉(zhuǎn)換記憶 B 細(xì)胞 SMB 和過渡 B 細(xì)胞 TBC 顯著減少。IC 組中活化 B 細(xì)胞占 46.32%，B 細(xì)胞異?；罨崾?IC 膀胱中存在較強的體液免疫反應(yīng)。隨后的尿液抗體檢測發(fā)現(xiàn) IC 患者尿液中 IgE 明顯升高，提示 IgE 可作為 IC 潛在的快速診斷標(biāo)記物（圖2 l）。

3、髓系細(xì)胞的亞群分析

髓系細(xì)胞再聚類發(fā)現(xiàn) 6 種細(xì)胞類型（圖3 a）。IC 組中主要的細(xì)胞類型為中性粒細(xì)胞（51.20%），與對照相比，其差異基因顯著富集于抗原提呈和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路相關(guān)（圖3 b-c）。有趣的是臨床中常用于鑒別 IC 的肥大細(xì)胞其數(shù)量并不多，組間也無統(tǒng)計學(xué)差異（圖3 b）。

擬時序分析描繪了從 CD14+?巨噬細(xì)胞到 M2 樣巨噬細(xì)胞的分化軌跡（圖3 d、e），在分化過程中，促炎基因在 CD14+?巨噬細(xì)胞中上調(diào)，隨著病程進(jìn)展逐漸下調(diào)。同時，吞噬基因和調(diào)控受體在 M2 樣巨噬細(xì)胞中逐漸上調(diào)（圖3 f）。與對照相比，CD14+?巨噬細(xì)胞的功能與促炎有關(guān)（圖3 g）。而 M2 樣巨噬細(xì)胞則主要通過 MHCII 類分子調(diào)節(jié)免疫（圖3 h），其差異基因主要富集于自身免疫性疾?。▓D3 i）。兩種巨噬細(xì)胞的功能變化與 IC 從炎癥到纖維化的轉(zhuǎn)歸相關(guān)。隨后的免疫熒光驗證了兩種巨噬細(xì)胞的存在（圖3 j）。

4、CyTOF 驗證免疫細(xì)胞亞群
前三部分文章通過 scRNA-seq 構(gòu)建了 IC 膀胱免疫圖譜。隨后通過 CyTOF 對上述結(jié)果進(jìn)行蛋白水平的驗證，結(jié)果表明 IC 膀胱中的主要細(xì)胞類型及比例變化均與 scRNA-seq 結(jié)果保持一致，進(jìn)一步驗證了 IC 膀胱的免疫細(xì)胞圖譜（圖4）。

5、IC 膀胱中的免疫互作網(wǎng)絡(luò)

研究者對圖譜中的免疫細(xì)胞進(jìn)行受配體分析并通過細(xì)胞間的相互作用構(gòu)建了 IC 組的免疫激活網(wǎng)絡(luò)（圖5 a-b），結(jié)果發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞可能協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞在 IC 患者膀胱中的轉(zhuǎn)移、歸巢和激活，造成強烈的炎癥反應(yīng)（圖5 c-d）。通過 ELISA 證實了新發(fā)現(xiàn)的趨化因子 CCL5 在 IC 患者尿液中的高表達(dá)（圖5 e)，表明 CCL5 可能是一個潛在的尿液生物標(biāo)志物。
IC 膀胱中 Tregs 表達(dá)的 IL-10 和 IL-35 的顯著減少（圖5 f），而同時發(fā)現(xiàn) TGF-β 信號通路的上調(diào)（圖5 g），表明 IC 膀胱中 Tregs 的功能障礙，炎癥平衡能力受損。Tregs 功能障礙與 CD8+?T 細(xì)胞耗竭可能是 IC 炎癥持續(xù)的原因，最終導(dǎo)致 IC 膀胱解剖結(jié)構(gòu)破壞及纖維化轉(zhuǎn)歸。
此外， IC 患者尿路上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞差異基因富集于病毒感染相關(guān)功能（圖5 h-i）。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子也與病毒感染相關(guān)（圖5 j-k）。數(shù)量變化較大的細(xì)胞群，其差異基因也均與病毒感染相關(guān)。隨后，研究者收集了 IC 患者尿液進(jìn)行病毒檢測，結(jié)果在 IC 尿液中檢測到人類多瘤病毒-2（陽性率為95%，19/20），而對照中未發(fā)現(xiàn)（圖5 l）。這一發(fā)現(xiàn)將為 IC 的病因?qū)W和病理生理機制提供新的線索和理論依據(jù)。

6、ST 和 scRNA-seq 的 MIA 分析揭示 IC 與對照膀胱中免疫細(xì)胞的差異分布
取 IC 和對照膀胱進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，并進(jìn)行聚類分析和分群鑒定（圖6 a-d，h-j）。通過 marker genes 可辨認(rèn)膀胱解剖結(jié)構(gòu)。基因表征發(fā)現(xiàn)纖維化相關(guān)基因在 IC 組的不同細(xì)胞類型中高表達(dá)，而對照組則低表達(dá)，再次提示患者膀胱可能存在嚴(yán)重纖維化（圖6 e、k）。
隨后使用多模態(tài)交叉分析（MIA）聯(lián)合單細(xì)胞數(shù)據(jù)和空間數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) IC膀胱中免疫亞群幾乎都富集于尿路上皮區(qū)域或成纖維細(xì)胞附近（圖6 f），但只有部分免疫細(xì)胞亞群在對照組膀胱的尿路上皮和平滑肌細(xì)胞周圍被發(fā)現(xiàn)（圖6 l）。結(jié)果再次證實了尿路上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在 IC 發(fā)病中的重要作用。

總結(jié)

該研究利用單細(xì)胞 scRNA-seq、10x 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和質(zhì)譜流式（CyTOF）技術(shù)對 IC 膀胱免疫亞群和免疫微環(huán)境進(jìn)行研究。文章構(gòu)建了 IC 女性膀胱的空間免疫圖譜，確定了免疫細(xì)胞的亞群特征，并探索了它們之間的相互作用關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿路上皮細(xì)胞在 IC 的發(fā)生和進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用，尿路上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞可能協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞在 IC 患者膀胱中的歸巢、遷移和激活，而異常激活免疫細(xì)胞引發(fā)膀胱功能障礙，導(dǎo)致膀胱結(jié)構(gòu)破壞，造成膀胱的嚴(yán)重纖維化。此外，文章發(fā)現(xiàn)了一些具有潛在診斷功能的尿液標(biāo)志物，同時發(fā)現(xiàn)患者尿液中 2 型多瘤病毒的存在，本文為研究 IC 的病理生理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

Peng L, Jin X, Li BY, Zeng X, Liao BH, Jin T, Chen JW, Gao XS, Wang W, He Q, Chen G, Gong LN, Shen H, Wang KJ, Li H, Luo DY. Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis.?Signal Transduct Target Ther. 2022 May 20;7(1):161. doi: 10.1038/s41392-022-00962-8.