ADAM 8，ADAM 15和MDC-L（ADAM 28）的淬滅熒光（FRET）底物，而ADAM 17沒(méi)有。

編號(hào): 121525

中文名稱: FRET底物、FRET Substrates

CAS號(hào): 1926163-42-9

單字母: H2N-E(Edans)-KPAKFFRL-K(Dabcyl)-NH2

三字母: H2N-Glu(Edans)-Lys-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dabcyl)-NH2

氨基酸個(gè)數(shù): 10

分子式: C78H125N21O15S1

平均分子量: 1629.02

精確分子量: 1627.94

等電點(diǎn)(PI): -

pH=7.0時(shí)的凈電荷數(shù): 3.97

平均親水性: 0.24285714285714

疏水性值: -0.34

來(lái)源: 人工化學(xué)合成，僅限科學(xué)研究使用，不得用于人體。

純度: 95%、98%

鹽體系: 可選TFA、HAc、HCl或其它

儲(chǔ)存條件: 負(fù)80℃至負(fù)20℃

標(biāo)簽: 熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽(FRET) 酶底物肽 DABCYL標(biāo)記肽 EDANS修飾肽

實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)述

以熒光物質(zhì)CFP（供體）-YFP（受體）為例，檢測(cè)AB蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)特定的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染，觀察檢測(cè)分子在細(xì)胞內(nèi)的相互作用；
2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：構(gòu)建質(zhì)粒載體CFP-A和YFP-B，將檢測(cè)的AB蛋白分別偶聯(lián)上熒光蛋白CFP和YFP，并將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)；
3. 檢測(cè) FRET：質(zhì)粒載體CFP-A和YFP-B轉(zhuǎn)染細(xì)胞 10h、12h、18h、24h、36h、48h、72h 后檢測(cè)，是否發(fā)生Fret；
4. FRET圖像采集： 確定 FRET 配對(duì)的激發(fā)波長(zhǎng)， 藍(lán)光被調(diào)諧分別用于探測(cè)最大和最小的供體和受體信號(hào)， 最大供體信號(hào)和最小受體信號(hào)對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)用于收集雙表達(dá)細(xì)胞的 FRET信號(hào)。調(diào)整激光變化，以便獲取最大 CFP 信號(hào)和最小 YFP 信號(hào)的激發(fā)光波長(zhǎng)， 采集供體和受體圖像，收集 FRET 信號(hào)。每個(gè)細(xì)胞 FRET 檢測(cè)重復(fù) 3 次，每種轉(zhuǎn)染至少完成 6 個(gè)細(xì)胞的 FRET 檢測(cè);
5. FRET 數(shù)據(jù)處理： 去除 FRET 信號(hào)中 DSBT 和 ASBT 的光譜串色信號(hào)； 受體通路的FRET 信號(hào)需要對(duì)供體受體光譜靈敏度的變化進(jìn)行矯正、對(duì)自發(fā)熒光和光學(xué)噪聲進(jìn)行矯正； 利用矯正系數(shù)對(duì)雙標(biāo)定細(xì)胞進(jìn)行象素匹配矯正。

案例

最常見(jiàn)的一對(duì)標(biāo)記組合是 Dancyl和Edans。

在本例中，熒光團(tuán) (EDANS) 和猝滅劑 (DABCYL) 與 HIV 蛋白酶的天然底物相連。在未裂解的底物中，DABCYL 淬滅 EDANS，因此沒(méi)有可檢測(cè)到的熒光。底物被 HIV-1 蛋白酶切割后，DABCYL 不再淬滅 EDANS，從而檢測(cè)到 EDANS 熒光。然后可以監(jiān)測(cè) EDANS 熒光強(qiáng)度的變化以評(píng)估蛋白酶抑制劑的效率。

FRET 肽可用于研究肽酶特異性，因?yàn)樗鼈兛梢赃B續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)，從而快速確定酶活性。供體/受體對(duì)之間的肽鍵可以被切割，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)以測(cè)量納摩爾濃度的酶活性。當(dāng)未被切割時(shí)，F(xiàn)RET 肽會(huì)淬滅內(nèi)部熒光；然而，供體/受體對(duì)之間肽鍵的斷裂會(huì)釋放出可以連續(xù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)，從而可以量化酶的活性。

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