哈嘍，大家好，小薇又跟大家見(jiàn)面啦~ 今天小薇給大家分享點(diǎn)干貨，怎么樣分析單基因通過(guò)某信號(hào)通路來(lái)調(diào)控非腫瘤疾病的機(jī)制研究設(shè)計(jì)，這樣的套路學(xué)會(huì)了應(yīng)用面很廣哈。那小薇就以下面這篇文獻(xiàn)為例，4步教會(huì)大家怎么樣設(shè)計(jì)“干濕結(jié)合分析單基因通過(guò)信號(hào)通路調(diào)控非腫瘤機(jī)制”實(shí)驗(yàn)，一起跟著小薇往下看看吧~

第一步：TOP2A在反復(fù)自然流產(chǎn)（RSA）中的表達(dá)情況

首先，作者分析了在RSA組織樣本中TOP2A的表達(dá)情況，免疫組織化學(xué)顯示，TOP2A定位于絨毛組織的核質(zhì)中，RSA患者的TOP2A表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P<0.001）（圖1A）。WB分析顯示，與正常組相比，RSA患者絨毛中TOP2A蛋白的表達(dá)減少（P<0.01）（圖1B），這與qRT-PCR分析的結(jié)果一致（P<0.01）（圖1C）?？傊@些結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，RSA患者的絨毛中TOP2A表達(dá)降低。

第二步：研究TOP2A對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能影響

為了進(jìn)一步研究TOP2A在RSA中的作用，評(píng)估了TOP2A蛋白在滋養(yǎng)層細(xì)胞系中的表達(dá)，包括JEG-3、HTR8/Svneo細(xì)胞。將靶向TOP2A sh-RNA和TOP2A過(guò)表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到JEG-3和HTR8細(xì)胞中，以產(chǎn)生TOP2A敲低（sh-TOP2A）和TOP2A過(guò)度表達(dá)（OE-TOP2A）細(xì)胞。WB和qRT-PCR檢測(cè)敲低和過(guò)表達(dá)的效率（P<0.05）（圖2A，B和3A，B）。WB分析顯示，與sh-NC組相比，sh-TOP2A組的TOP2A表達(dá)下降（P<0.001），這與qRT-PCR分析結(jié)果一致（P<0.05）。此外，OE-TOP2A組HTR8細(xì)胞中TOP2A蛋白水平是載體組的1.3倍，這與qRT-PCR結(jié)果一致（P<0.05）。TOP2A敲低顯著降低了EDU標(biāo)記的細(xì)胞被標(biāo)記的比例，表明細(xì)胞增殖下調(diào)（圖2E）。

凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3在sh-TOP2A JEG-3細(xì)胞中的表達(dá)增加（P<0.05），而在OE-TOP2A?

HTR8/Sveno

細(xì)胞中表達(dá)減少（P<0.01）。Pro-caspase3不受TOP2A敲低或過(guò)表達(dá)的影響（圖2C和3D）。qRT-PCR分析表明，與sh-NC組相比，sh-TOP2A組中增殖相關(guān)基因Ki67下調(diào)（P<0.05），促凋亡基因bim、bax和caspase7上調(diào)（P<0.05）；而在OE-TOP2A中觀察到相反的結(jié)果（P<0.05）（圖2D和3C）。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，TOP2A的過(guò)表達(dá)降低了細(xì)胞凋亡率（P＜0.0001），而在sh-TOP2A組中觀察到相反的結(jié)果（P＜0.001）（圖2G和3E）。TUNEL測(cè)定中的熒光強(qiáng)度也支持這些發(fā)現(xiàn)（圖2F）。

利用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析TOP2A表達(dá)失調(diào)對(duì)細(xì)胞周期的影響（圖2H和3F）。TOP2A過(guò)表達(dá)在HTR8細(xì)胞中導(dǎo)致S期細(xì)胞百分比顯著增加（P<0.05）。而TOP2A下調(diào)在JEG-3細(xì)胞中導(dǎo)致G1期阻滯（P<0.001）。至于G2期，TOP2A敲低組和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組沒(méi)有觀察到差異。

Transwell和傷口愈合測(cè)定用于進(jìn)一步研究TOP2A是否可以影響JEG-3細(xì)胞的侵襲和遷移。如圖4所示，與sh-NC組相比，sh-TOP2A組的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.05）。接著通過(guò)qRT-PCR和WB來(lái)評(píng)估TOP2A對(duì)侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)與sh-NC組相比，sh-TOP2A組中促進(jìn)侵襲的MMP-2和MMP-9的表達(dá)降低（P<0.01）（圖4D，E）。因此，表明TOP2A對(duì)遷移和侵襲具有積極作用。

總之，這些結(jié)果表明，缺乏TOP2A可能會(huì)導(dǎo)致早期胎盤(pán)淺層植入，這在一定程度上會(huì)導(dǎo)致RSA。

第三步：分析TOP2A涉及RSA的潛在機(jī)制

接著為了分析TOP2A涉及RSA的潛在機(jī)制，對(duì)sh-NC和sh-TOP2A組進(jìn)行RNA測(cè)序，以確定TOP2A相關(guān)基因和下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在sh-NC和sh-TOP2A組共鑒定出1764個(gè)差異表達(dá)基因，包括798個(gè)上調(diào)基因和966個(gè)下調(diào)基因（圖5A、B）。利用富集分析用于分析TOP2A相關(guān)通路（圖5C-E），發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集的通路包括FOXO信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡和mTOR信號(hào)通路。

為了進(jìn)一步研究TOP2A是否通過(guò)FOXO信號(hào)通路介導(dǎo)其功能，測(cè)量了FOXO信號(hào)通路相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與sh-NC組相比，敲低TOP2A降低了sh-TOP2A組中p-FoxO1、p-FoxO3a和p-Rb的水平（P<0.05）（圖6A）。此外，使用qRT-PCR評(píng)估細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，包括Foxo1、cyclinD3、p27和CDK6（P<0.05）（圖6C），所得到的結(jié)果也與預(yù)測(cè)相符。數(shù)據(jù)顯示，TOP2A通過(guò)調(diào)節(jié)FOXO信號(hào)通路中蛋白質(zhì)的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。為了進(jìn)一步證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，使用HTR8細(xì)胞系來(lái)驗(yàn)證下游信號(hào)分子的表達(dá)。在OE-TOP2A組中，與NC組相比p-FoxO1、p-FoxO3a、CDK4、CDK6和cyclinE1的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）。一致地，qRT-PCR分析顯示，在OE-TOP2A組中，CyclinD1、CDK4和CDK6的mRNA表達(dá)上調(diào)，其中與P18、P21和P27的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)一樣（P<0.05）?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明，TOP2A在JEG-3和HTR8細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期中的調(diào)節(jié)作用可能與FOXO信號(hào)通路有關(guān)。

為了證實(shí)TOP2A通過(guò)調(diào)節(jié)FOXO信號(hào)通路在介導(dǎo)細(xì)胞功能中的作用，使用了一種特異性FoxO1抑制劑AS1842856來(lái)抑制FOXO通路。如圖6B所示，經(jīng)TOP2A敲除并用FoxO1抑制劑處理的JEG-3細(xì)胞顯示p-FoxO1表達(dá)增加，這表明增殖恢復(fù)（p<0.05）。此外，qRT-PCR分析顯示，與sh-TOP2A組相比，sh-TOP2A聯(lián)合 AS1842856治療組中CDK抑制劑（包括p18、p21、p27和Bim）的mRNA表達(dá)降低，而CDK4、CDK6和Cyclin D1的mRNA表達(dá)顯著增加（P<0.05）（圖6D）。因此，在一定程度上抑制FOXO信號(hào)通路可以挽救TOP2A敲低引起的增殖和凋亡的減少。

第四步：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TOP2A的作用

圖7A顯示了用于獲得和處理植入前胚胎的方案。為了進(jìn)一步闡明TOP2A在小鼠胚胎發(fā)育和滋養(yǎng)外胚層分化中的作用，在含有選擇性TOP2A抑制劑PluriSIn的培養(yǎng)基中培養(yǎng)了兩個(gè)細(xì)胞胚胎。結(jié)果，在PluriSIn2處理組中，胚胎發(fā)育率顯著降低（圖7C）。如圖7D（P<0.001），PluriSIn2處理組的滋養(yǎng)外胚層分化低于對(duì)照組。

據(jù)報(bào)道，ZGA相關(guān)基因的下調(diào)與早期小鼠胚胎發(fā)育障礙有關(guān)。因此，進(jìn)行了qRT-PCR分析，以評(píng)估PluriSIn2是否可以通過(guò)下調(diào)ZGA相關(guān)基因來(lái)降低胚胎質(zhì)量。如圖7E，在處理組或未處理組中，基因SCAN4B（Zscan4b）、Eif1a、熱休克因子1等的mRNA表達(dá)沒(méi)有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

接下來(lái)，研究了TOP2A的抑制是否會(huì)導(dǎo)致ROS的積累，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩。為了探索PluriSIn2介導(dǎo)的TOP2A抑制作用的機(jī)制，使用共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)胚胎中線粒體超氧化物（反映ROS水平的指標(biāo)）。如圖7F所示，用PluriSIn2處理的四細(xì)胞胚胎的線粒體超氧化物水平顯著高于對(duì)照胚胎（P<0.05）。鑒于ROS的積累會(huì)損害線粒體膜的通透性，對(duì)JC-1進(jìn)行了染色，以比較PluriSIn2處理組和未處理組的熒光強(qiáng)度。與對(duì)照組相比，用PluriSIn2孵育的胚胎顯示出顯著增加的綠色熒光，這表明線粒體膜電位降低（P<0.05）（圖7G）。

最后利用一張圖來(lái)幫大家串一下文章的主要研究?jī)?nèi)容吧~ 簡(jiǎn)單四步，先分析單基因在疾病中的表達(dá)，接著在體外分析單基因在疾病中的作用，然后測(cè)序分析其涉及的機(jī)制，最后在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

好啦，今天小薇就給大家分享到這里啦，其實(shí)這樣的套路可應(yīng)用還是很多的，你get到啦嘛？有問(wèn)題的小伙伴可以留言哈~ 沒(méi)有研究方向的小伙伴也不要著急，小薇這里還提供實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)服務(wù)，有需要的小伙伴隨時(shí)聯(lián)系小薇，小薇一直都在~