來源：中科院之聲

近日，中國科學(xué)院北京生命科學(xué)研究院趙方慶教授團隊在《自然-實驗手冊》（Nature Protocols）上，發(fā)表了題為Full-length circular RNA profiling by nanopore sequencing with CIRI-long的研究論文，建立了環(huán)狀RNA全長轉(zhuǎn)錄本解析和高效挖掘的技術(shù)體系。

近年的研究表明，環(huán)狀RNA在真核生物體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)功能。環(huán)狀RNA序列與線性RNA相似度高，因此如何高效鑒定環(huán)狀RNA特有的外顯子結(jié)構(gòu)，是環(huán)狀RNA研究中的重要問題。針對這一問題，趙方慶教授團隊前期提出了CIRI-AS算法（基于BSJ讀段對比結(jié)果對環(huán)狀RNA內(nèi)部可變剪接結(jié)構(gòu)進行識別）。后續(xù)研究開發(fā)了CIRI-full算法（通過識別雙端250bp測序數(shù)據(jù)中反向重疊區(qū)特征，對500bp以內(nèi)的環(huán)狀RNA進行全長重構(gòu)）。由于上述方法主要基于短讀長測序技術(shù)，難以對長度500bp以上的環(huán)狀RNA的全長序列進行有效識別。在此基礎(chǔ)上，研究組開發(fā)了基于納米孔測序的環(huán)狀RNA全長測定方法CIRI-long，實現(xiàn)了對不同長度環(huán)狀RNA全長結(jié)構(gòu)的高效鑒定。

該研究利用小鼠腦組織及人HeLa細胞系樣本作為示例，闡釋了環(huán)狀RNA高效富集與全長測定方法：利用核糖體RNA去除試劑盒與改進的RNase R處理流程，消化RNA樣本中的核糖體RNA與其余線性RNA分子，對環(huán)狀RNA進行初步富集；利用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴增，構(gòu)建cDNA文庫。在該過程中，環(huán)狀RNA模板可以發(fā)生滾環(huán)逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生含有多個環(huán)狀RNA全長序列的嵌合體cDNA，而來自線性RNA的cDNA產(chǎn)物長度較短。

因此，后續(xù)流程中使用了片段篩選策略，對環(huán)狀RNA來源的cDNA片段進行了進一步富集，從而有效提升了文庫中環(huán)狀RNA來源片段所占比例。該工作利用長讀長納米孔測序技術(shù)進行cDNA分子的全長測定，并使用該團隊開發(fā)的CIRI-long算法對測序數(shù)據(jù)中的環(huán)狀RNA序列進行識別與錯誤校正，從而獲得高置信度的環(huán)狀RNA全長結(jié)構(gòu)。

前期研究觀察到使用具有模板切換活性的逆轉(zhuǎn)錄酶，可以在滾環(huán)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA末端直接引入PCR引物序列，從而實現(xiàn)對低起始量環(huán)狀RNA的高效捕獲（圖1）。然而，該活性依賴5’RNA線性末端參與，因此不含5’與3’線性末端的環(huán)狀RNA如何發(fā)生模板切換的原理尚未明確。該工作進一步利用體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建的模式環(huán)狀RNA探究滾環(huán)逆轉(zhuǎn)錄過程發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后，大部分環(huán)狀RNA模板發(fā)生了水解，從而提供了模板切換所需的線性5’末端。同時，在不加入逆轉(zhuǎn)錄酶的對照組中，環(huán)狀RNA均保持了完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這提示環(huán)狀RNA滾環(huán)反轉(zhuǎn)錄中的模板切換主要依賴RNA模板的線性化水解，為CIRI-long流程提供了重要的理論支持。?

同時，該研究總結(jié)了CIRI-long方法的應(yīng)用，提出了CIRI-long方法可為新型環(huán)狀RNA如線粒體來源環(huán)狀RNA或內(nèi)含子自連型環(huán)狀RNA的存在提供有力的支持證據(jù)。同時，重構(gòu)獲得的環(huán)狀RNA全長序列可用于后續(xù)環(huán)狀RNA的功能預(yù)測（如miRNA或RBP結(jié)合位點分析）。此外，利用長讀長測序方法構(gòu)建出的環(huán)狀RNA序列，可作為評估基于傳統(tǒng)二代測序技術(shù)的環(huán)狀RNA拼接算法的標準數(shù)據(jù)集，為現(xiàn)有算法的改進提供指導(dǎo)方向。與近年開發(fā)的多個長讀長環(huán)狀RNA測序技術(shù)相比，CIRI-long方法實驗步驟更為便捷，同時可實現(xiàn)對不同長度環(huán)狀RNA全長結(jié)構(gòu)的直接測定，可應(yīng)用于多種組織與細胞樣本，頗具應(yīng)用前景。

研究工作得到國家自然科學(xué)基金國家杰出青年科學(xué)基金項目和重點項目的支持。