大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。

在植物中，5mC DNA甲基化修飾（簡(jiǎn)稱5mC甲基化）是一個(gè)重要而保守的表觀基因標(biāo)記，參與基因組穩(wěn)定性、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、發(fā)育調(diào)控、非生物脅迫響應(yīng)、代謝物合成等多種調(diào)控。茶樹（Camellia sinensis(L.)O.Kuntze）是一種缺乏成熟遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的非模式作物，迄今為止，對(duì)這種重要飲料植物的表觀遺傳學(xué)維度的研究很少。5mC甲基化在茶樹生長(zhǎng)發(fā)育（采前加工）以及采前和采后加工中風(fēng)味物質(zhì)合成中的作用尚不清楚。

2023年08月01日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組所孔維龍為第一作者和通訊作者、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組所張興坦研究員為共同通訊作者在《Hortic. Res.》雜志在線發(fā)表了題為“5mC DNA methylation modification-mediated regulation in tissue functional differentiation and important flavor substance synthesis of tea plant (Camellia sinensis L.)”的研究論文，該研究利用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）和對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析等實(shí)驗(yàn)揭示了5mC DNA甲基化修飾介導(dǎo)的茶樹組織功能分化和重要風(fēng)味物質(zhì)合成調(diào)控機(jī)制。

標(biāo)題：5mC DNA methylation modification-mediated regulation in tissue functional differentiation and important flavor substance synthesis of tea plant (Camellia sinensis L.)（5mC DNA甲基化修飾介導(dǎo)的茶樹組織功能分化和重要風(fēng)味物質(zhì)合成調(diào)控）

發(fā)表期刊：Horticulture Research

發(fā)表日期：2023年08月01日

影響因子：IF 8.7/ 1區(qū)

技術(shù)：全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）、RNA-seq、代謝組等

樣品及方法：

以國(guó)家品種“鐵觀音”烏龍茶為材料，采葉標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉或三葉。所有新鮮的葉子都在下午4點(diǎn)左右采摘（新鮮樣本）。收獲后的鮮葉先在陽光下萎凋35分鐘，然后轉(zhuǎn)移到室內(nèi)萎凋15分鐘（萎凋處理樣本）。萎凋后，用搖床以25 r/min對(duì)茶葉進(jìn)行三次搖動(dòng)（搖動(dòng)處理樣本）。隨機(jī)采集100g樣品作為新鮮、萎凋和搖動(dòng)的三個(gè)處理樣品，每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。共收集9個(gè)樣本進(jìn)行代謝組、RNA-seq和WGBS-seq測(cè)序。

摘要

本研究應(yīng)用無偏好性的全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）對(duì)烏龍茶采摘后加工過程中的四個(gè)關(guān)鍵采前組織（根、葉、花和果）和兩個(gè)加工葉片進(jìn)行了全面的DNA甲基化分析。分析結(jié)果表明，四個(gè)關(guān)鍵組織之間的差異性5mC甲基化與組織功能分化密切相關(guān)，并且與非組織特異性表達(dá)基因相比，負(fù)責(zé)組織特異性功能的組織特異性基因維持相對(duì)較低的5mC甲基水平。根中CsAlaDC和TS/GS基因的低甲基化修飾為根中茶氨酸（theanine）的顯性合成提供了分子基礎(chǔ)。此外，對(duì)采集后葉片的5mC DNA甲基化組學(xué)、代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的綜合分析表明，烏龍茶加工過程中風(fēng)味代謝物含量變化與相應(yīng)代謝物合成基因的轉(zhuǎn)錄水平變化密切相關(guān)，且這些重要合成基因的轉(zhuǎn)錄水平變化受5mC甲基化嚴(yán)格調(diào)控。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，加工過程中的一些關(guān)鍵基因受5mC甲基化調(diào)控，促進(jìn)α-法尼烯（α-Farnesene）、橙花叔醇（nerolidol ）、脂質(zhì)（lipids）和茶多酚（catechins）等味覺物質(zhì)的重要香氣代謝物含量變化。本研究結(jié)果不僅闡明了5mC甲基化在采前和采后加工中重要風(fēng)味物質(zhì)合成中的關(guān)鍵作用，還為未來茶葉品質(zhì)的改善或全組織高茶氨酸品種的選育提供了表觀突變相關(guān)基因靶點(diǎn)。

研究結(jié)果：

（1）5mC甲基化在茶樹采前組織功能分化中起重要調(diào)控作用

圖1：茶樹的四個(gè)關(guān)鍵采前組織中不同5mC甲基化水平

（A）不同組織的WGBS-seq數(shù)據(jù)的Pearson相關(guān)系數(shù)熱圖。

（B）組織中CHH、CHG和CG的甲基化水平。

（C）組織特異性表達(dá)基因數(shù)量。

（D）組織特異性和非組織特異性表達(dá)基因5mC甲基化水平差異。

（E）根組織特異性低甲基化基因的GO注釋。

（2）5mC甲基化參與調(diào)控茶樹根系中顯性茶氨酸合成和非生物脅迫響應(yīng)

圖2：5mC甲基化參與調(diào)控茶樹根系中顯性茶氨酸合成和非生物脅迫響應(yīng)。

（A） 茶氨酸合成的關(guān)鍵底物和基因。

（B） CsAlaDC和TS/GS基因在四種茶樹組織中的表達(dá)水平。

（C） 四種茶樹組織中CsAlaDC和TS/GS基因的甲基化水平。

（D） CsAlaDC和TS/GS基因在四種茶樹組織中的相對(duì)表達(dá)水平。

（E） 保守CHH高甲基化基因和低甲基化基因的GO注釋。

（3）烏龍茶采后加工過程中應(yīng)激引起的代謝物變化

圖3：烏龍茶采后加工過程中代謝物的變化。

（A） 1377種次生代謝物的分類。

（B） UPLC–MS/MS檢測(cè)非揮發(fā)性代謝物含量的相關(guān)結(jié)果。

（C） GC–MS檢測(cè)揮發(fā)性代謝物含量的相關(guān)性結(jié)果。

（D） 三個(gè)加工處理點(diǎn)所有代謝物的總含量變化。

（E） 三個(gè)加工處理點(diǎn)不同類別代謝物含量的變化。

（F） 各加工點(diǎn)新出現(xiàn)的代謝物。

（4）烏龍茶采后加工過程中差異代謝物及差異表達(dá)基因的鑒定

圖4：烏龍茶采后加工中的差異代謝物（DMs）和差異表達(dá)基因（DEGs）。

（A） 不同加工處理點(diǎn)之間的次生代謝物差異。

（B） 所有差異次生代謝物的K-均值聚類。

（C） 各子類的詞云圖（Word cloud map）。

（D） 主要香氣物質(zhì)含量變化熱圖。

（E） 重要茶多酚含量變化熱圖。

（F） 不同處理點(diǎn)之間的DEG數(shù)量。

（G） DEG的KEGG富集通路。

C：新鮮茶葉；W：萎凋處理茶葉；T：搖動(dòng)處理茶葉。

（5）烏龍茶采后加工中的單堿基分辨5mC甲基化模式

圖5：烏龍茶三個(gè)重要加工處理點(diǎn)的單堿基分辨5mC DNA甲基化圖譜。

（A） 基因密度（a）、轉(zhuǎn)座子密度（b）、GC含量（c）、CG、CHH和CHG 5mC甲基化水平（d-f）和基因表達(dá)水平（g）的Circos圖。在d–g中，從外到內(nèi)依次為：新鮮茶葉、萎凋處理茶葉和搖動(dòng)處理茶葉。

（B） 烏龍茶三個(gè)重要加工處理點(diǎn)的DNA甲基化水平。

（C） 烏龍茶三個(gè)加工處理點(diǎn)的甲基化胞嘧啶數(shù)量。

（D） 每個(gè)加工點(diǎn)5mC甲基化水平分類。

（E） 三個(gè)不同加工點(diǎn)的基因和轉(zhuǎn)座子甲基化水平。

C和D中：C1–C3，新鮮茶葉；W1–W3，萎凋處理茶葉；T1–T3，搖動(dòng)處理茶葉。

（6）5mC甲基化參與采后加工中風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的表觀調(diào)控

圖6：烏龍茶加工過程中DMR和DMR介導(dǎo)的DEG。

（A） DMR的數(shù)量。

（B） DMR在基因組中的位置分布。

（C） DMR介導(dǎo)的DEG數(shù)量。

（D） DMR介導(dǎo)的與重要風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)的DEG基因表達(dá)水平熱圖。

（E） 橙花叔醇合成酶（NES）基因的WGBS-seq（CHH）和RNA-seq數(shù)據(jù)的IGV（Integrative Genomics Viewer）可視化。（F） WGBS-seq（CHH）的IGV可視化和4-coumaroyl-CoA (CsTGY13G0000351)基因的RNA-seq數(shù)據(jù)。

關(guān)于易基因全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）

全基因組重亞硫酸鹽甲基化測(cè)序（WGBS）可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測(cè)所有單個(gè)胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn)。WGBS能為基因組DNA甲基化時(shí)空特異性修飾的研究提供重要技術(shù)支持，能廣泛應(yīng)用在個(gè)體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機(jī)制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。

易基因全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，進(jìn)而通過接頭序列介導(dǎo)的 PCR 技術(shù)將尿嘧啶U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏。

應(yīng)用方向：

WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯(cuò)過關(guān)鍵位點(diǎn)）

• 全基因組甲基化圖譜課題

• 標(biāo)志物篩選課題

• 小規(guī)模研究課題

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• 應(yīng)用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；

• 全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；

• 單堿基分辨率：可精確分析每一個(gè)C堿基的甲基化狀態(tài)。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案，詳詢易基因：0755-28317900。

參考文獻(xiàn)：

Kong W, Zhu Q, Zhang Q, Zhu Y, Yang J, Chai K, Lei W, Jiang M, Zhang S, Lin J, Zhang X. 5mC DNA methylation modification-mediated regulation in tissue functional differentiation and important flavor substance synthesis of tea plant (Camellia sinensis L.). Hortic Res. 2023 Aug;10(8):uhad126.