環(huán)狀RNA（circRNAs）是剪接過程產(chǎn)生的共價(jià)封閉單鏈RNA分子。大多數(shù)真核circRNA是非編碼RNA，在基因表達(dá)中具有潛在的調(diào)控功能。然而，一小部分內(nèi)源性circRNA具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRESs），可以作為蛋白質(zhì)模板，以不依賴于帽的方式誘導(dǎo)翻譯。并且，大量的circRNA也可以在體外通過體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備circRNA。

circRNA可能作為免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用已被很多文獻(xiàn)報(bào)道。由于其共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)和沒有5‘帽或3’polyA尾巴、比線性RNA更穩(wěn)定，且可通過細(xì)胞外囊泡從細(xì)胞中釋放出來。這些特征可作為診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，應(yīng)用于臨床實(shí)踐，從而越來越引起了人們的關(guān)注。

最近，作為疫苗的候選者，circRNA開發(fā)成的疫苗被證明可以在非人類靈長類動(dòng)物中誘導(dǎo)對(duì)SARS-CoV-2的廣譜保護(hù)[1]。然而，circRNA在體內(nèi)識(shí)別、翻譯和激活信號(hào)導(dǎo)致保護(hù)性免疫的機(jī)制目前尚不清楚。

2023年5月8日，斯坦福大學(xué)Howard Y. Chang教授課題組在Proceedings of the National Academy of Sciences發(fā)表文章Circular RNA?vaccine induces potent T cell responses。文章表示，環(huán)狀RNA與線性mRNA相比高度穩(wěn)定，可提供持久的蛋白表達(dá)。作者用體外制備的circRNA（能編碼蛋白抗原）造成小鼠免疫，可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的先天激活，刺激淋巴結(jié)和組織中強(qiáng)大的抗原特異性CD8 T細(xì)胞反應(yīng)。種種跡象明示circRNA疫苗在刺激組織中先天免疫和T細(xì)胞反應(yīng)方面的潛在用途——作為治療性疫苗，誘導(dǎo)強(qiáng)大的細(xì)胞免疫，清除腫瘤。這些結(jié)果表明，體外制備的circRNA可用于疫苗開發(fā)和腫瘤治療。

circRNA與可溶性蛋白結(jié)合可在多種免疫途徑中作為優(yōu)秀的疫苗佐劑

佐劑可通過不同的作用方式增加免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，對(duì)于提高疫苗的有效性至關(guān)重要。研究表明，外源性circRNA在體內(nèi)與可溶性蛋白一起傳遞時(shí)，有助于誘導(dǎo)抗原特異性抗體和T細(xì)胞。但因?yàn)檫f送途徑不同可能會(huì)有不同的結(jié)果，作者進(jìn)一步用不同的免疫途徑來評(píng)估了circRNA作為疫苗配方中一種獨(dú)特佐劑的潛力。

體外合成circRNA和雞卵清蛋白（稱為OVAp）通過三種遞送策略（皮下、鼻內(nèi)和靜脈注射）免疫C57BL/6小鼠，另外加以陽性對(duì)照（AddaVax，皮下佐劑）輔助驗(yàn)證，在第7天和第30天測量了脾臟、引流淋巴結(jié)（LNs）和肺部T細(xì)胞和抗體反應(yīng)的大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circRNA+OVAp無論是哪種免疫途徑均能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng)，并效果優(yōu)于陽性對(duì)照。免疫后的抗體檢測發(fā)現(xiàn)，所有給藥途徑中觀察到血清中抗ovaIgG抗體的水平相似。此外，比較circRNA和Poly（I：C）作為鼻內(nèi)佐劑的免疫效果發(fā)現(xiàn)，circRNA和Poly（I：C）誘導(dǎo)肺部抗原特異性CD8 T細(xì)胞的頻率相當(dāng)。綜上所述，研究結(jié)果表明，circRNA可作為一種有效的疫苗佐劑用于多種免疫途徑，并可媲美Poly（I：C）和AddaVax的免疫應(yīng)答。

circRNA注射到小鼠體內(nèi)時(shí)，可激活先天免疫細(xì)胞，并誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的免疫激活

先天免疫系統(tǒng)在免疫反應(yīng)的大小、質(zhì)量和持久性方面起著重要作用。作者解析了circRNA接種后產(chǎn)生強(qiáng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)背后的機(jī)制。

首先確定了circRNA在體內(nèi)傳遞時(shí)的生物分布。在circRNA免疫前后，用Luminex先天細(xì)胞因子面板分析血清。將circRNA偶聯(lián)到熒光團(tuán)AF488上，并皮下注射（s.c.）AF488-circRNA到C57BL/6小鼠。免疫24小時(shí)后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析引流腹股溝淋巴結(jié)（iLNs）中的先天免疫細(xì)胞亞群。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circRNA在單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和一些巨噬細(xì)胞亞群中被檢測到。巨噬細(xì)胞亞群包括邊緣脊髓巨噬細(xì)胞（MCMs）、邊緣竇巨噬細(xì)胞（MSMs）和囊膜下竇巨噬細(xì)胞（SSM），其中circRNA顯著富集于MCMs和MSMs。盡管小鼠中B細(xì)胞沒有檢測到circRNA，但B細(xì)胞頻率顯著增加，CD86上調(diào)檢測B細(xì)胞激活也增加，并且單核細(xì)胞的頻率和激活顯著增加，所有巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞亞群的激活也顯著增加，血清中的炎癥免疫因子對(duì)circRNA免疫的反應(yīng)也較為強(qiáng)烈。綜上所述，circRNA注射到小鼠體內(nèi)時(shí)，誘導(dǎo)幾種先天免疫細(xì)胞激活，同時(shí)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生強(qiáng)烈反應(yīng)。

樹突狀細(xì)胞（DCs）是最有效的抗原呈遞細(xì)胞，負(fù)責(zé)抗原加工和呈遞、遷移和T細(xì)胞共刺激。作者發(fā)現(xiàn)，circRNA可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的成熟，從而增加了共刺激分子的表達(dá)和多種炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的分泌。

CART傳遞工程circRNA改善蛋白編碼從而呈遞抗原

circRNA可激活先天免疫已被證實(shí)。作者隨后研究circRNA在作為佐劑和抗原編碼序列時(shí)，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的能力。

作者使用優(yōu)化的元件來進(jìn)行circRNA（編碼circRNA的雞卵清蛋白-circOVA）的設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)錄，從而為了使得circRNA翻譯效果超過mRNA。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表示，circOVA具有翻譯能力。

作者使用CART遞送circRNA，這是一種合成的可降解材料，可以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜、保護(hù)和高效地遞送mRNA和circRNA，從而導(dǎo)致高效的蛋白質(zhì)翻譯。CART-circOVA轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，由circRNA編碼的蛋白質(zhì)可以被樹突細(xì)胞加工并呈現(xiàn)給免疫系統(tǒng)。

隨后作者單獨(dú)用CART、circRNA或CART-circRNA免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CART傳遞的circRNA導(dǎo)致了先天免疫亞群的激活譜，這與之前觀察到的circRNA相似。

circRNA編碼的抗原在體內(nèi)誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng)

CART的效果已被證明，且具有較高的包封效率、良好的耐受性和非免疫原性，此外作者也驗(yàn)證了CART傳遞circRNA可產(chǎn)生穩(wěn)定和持續(xù)的蛋白質(zhì)（腹腔注射）。因此，作者在circRNA上再度進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CART-circOVA在肺、脾臟和血液中誘導(dǎo)了CD8 T細(xì)胞的有效反應(yīng)，是circRNA+OVAp的6-8倍。此外，抗體反應(yīng)檢測發(fā)現(xiàn)，與CART-circOVA相比，circRNA+OVAp誘導(dǎo)的抗OVAIgG一致且顯著升高，但CART-circOVA組仍可檢測到抗OVA抗體）。缺乏一致的抗體反應(yīng)分析原因可能是由于CART-circOVA免疫后蛋白分泌減少；免疫24小時(shí)后的血液中無法檢測到OVA蛋白與此分析結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，CART-circRNA免疫策略導(dǎo)致T細(xì)胞偏倚反應(yīng)，可能需要進(jìn)一步優(yōu)化來誘導(dǎo)對(duì)circOVA的抗體反應(yīng)。

接下來，作者試圖確定circRNA和CART的組合是否可以推廣到其他候選疫苗。流感病毒是突變最快的病毒之一，針對(duì)病毒保守位點(diǎn)（如核蛋白）的CD8 T細(xì)胞已被證明對(duì)異亞型流感感染具有保護(hù)作用。因此，作者構(gòu)建了一個(gè)編碼流感病毒（PR8株）核蛋白（NP）序列的circRNA，稱為circNP。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circNP+CART（CART-circNP）腹腔注射后，在血液中誘導(dǎo)核蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)。結(jié)果表明，利用circRNA編碼病原體來源的抗原序列可以有效地誘導(dǎo)抗原特異性CD8 T細(xì)胞應(yīng)答。

circRNA疫苗可誘導(dǎo)抗腫瘤療效

癌癥疫苗接種的目的是誘導(dǎo)基于抗原特異性T細(xì)胞的細(xì)胞免疫，從而靶向和清除腫瘤細(xì)胞。用circOVA與CART復(fù)合物免疫后，在組織和血液中系統(tǒng)地觀察到強(qiáng)烈的細(xì)胞T細(xì)胞反應(yīng)，這提示circRNA可作為一種癌癥疫苗。

在小鼠治療方案中作者測試了circRNA疫苗的抗腫瘤療效。B16-F10-OVA黑色素瘤細(xì)胞接種在小鼠的背部皮下構(gòu)建腫瘤模型，然后被隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組（未治療）和CART-circOVA（疫苗）組。與未治療組相比，circRNA疫苗組具有明顯的腫瘤生長抑制作用。結(jié)果表明，circRNA免疫可作為有效抑制腫瘤生長的免疫治療策略。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1073/pnas.2302191120

參考文獻(xiàn)：

1.?L. Qu et al., Circular RNA vaccines against SARS-CoV-2 and emerging variants. Cell 185, 1728–1744.e16 (2022)