小伙伴們是不是經(jīng)常碰到需要檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，比如想知道材料或者合成的藥物與細(xì)胞處理后，怎么知道細(xì)胞存活量？敲除某個(gè)與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的基因以后，細(xì)胞是掛了還是增加了？?今天實(shí)驗(yàn)菌給您扒一扒如何目前常用的細(xì)胞增殖檢測(cè)方法。

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背景介紹

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細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的意義：?

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細(xì)胞增殖是細(xì)胞在周期調(diào)控的因子下，通過DNA復(fù)制等反應(yīng)，完成細(xì)胞分裂的過程。增殖檢測(cè)一般用于分析分裂中的細(xì)胞數(shù)量的變化，進(jìn)而反應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及活性，目前廣泛應(yīng)用于腫瘤生物學(xué)，分子生物學(xué)，藥代動(dòng)力學(xué)等領(lǐng)域。

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本文亮點(diǎn)?常見的細(xì)胞增殖檢測(cè)包含這些：?

1.直接計(jì)數(shù)法?

2.MTT檢測(cè)法?

3.MTS檢測(cè)法

4.CCK-8檢測(cè)法?

5.3H-TdR滲入法

6.Brdu/EdU檢測(cè)法

7.CFSE檢測(cè)法

8.刃天青還原法

9.活細(xì)胞蛋白酶底物法/ATP法

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這么多檢測(cè)方法，小主們是不是挑花眼啦，別急，別急，咱來詳細(xì)了解一下

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直接計(jì)數(shù)法

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直接利用計(jì)數(shù)板或計(jì)數(shù)儀得出細(xì)胞數(shù)目，對(duì)數(shù)目進(jìn)行分析比較。是檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法之一，簡(jiǎn)單易操作，也非常公認(rèn)，只是耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，所需細(xì)胞量多，當(dāng)然最重要的是 費(fèi)眼睛啦。

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MTT法

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在活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色甲臢化合物，用二甲基亞砜（DMSO）將其溶解成溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度（OD490或者570)，從而定量測(cè)定細(xì)胞的存活比例，細(xì)胞增殖越多越快，對(duì)應(yīng)的吸光度越高；細(xì)胞毒性越大，對(duì)應(yīng)的吸光度越低。

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MTS法?

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在活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能MTS還原成一種可溶于組織培養(yǎng)基的甲臢化合物，而死細(xì)胞無此功能。這種甲臢化合物在490nm的吸收值可以直接在96孔板上測(cè)量，而不需要另外作處理，操作比MTT法更為簡(jiǎn)潔方便。且測(cè)量的吸收值所表示的甲臢產(chǎn)物的數(shù)量與培養(yǎng)物中活性細(xì)胞的數(shù)量成正比。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系。

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CCK-8法?

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CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑中含有WST-8 —— 一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以為線粒體內(nèi)的脫氫酶驗(yàn)明正身。在脫氫酶作用下，WST-8被還原生成橙黃色的甲瓚產(chǎn)物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在OD 450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。

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3H-TdR滲入法?

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胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質(zhì)。用同位素3H標(biāo)記TdR即3H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DNA合成代謝過程，那之后的每一條新合成的DNA雙鏈像被安裝了GPS定位器一樣，都能被液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)到，通過測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，可以反映細(xì)胞DNA的代謝及細(xì)胞增殖情況。

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BrdU/EdU檢測(cè)法?

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Brdu（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）是一種胸腺嘧啶的衍生物，能代替胸腺嘧啶合成DNA，這種摻入是穩(wěn)定存在的，隨著DNA的復(fù)制進(jìn)入子細(xì)胞中。摻入到DNA的BrdU可通過抗BrdU單克隆抗體在組織切片或細(xì)胞爬片上顯示，能通過免疫熒光、流式細(xì)胞儀檢測(cè)合成DNA的量，判斷細(xì)胞的增殖能力。 BrdU抗體比較大，由于DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的位阻，BrdU抗體無法直接與雙鏈上的BrdU結(jié)合，需要對(duì)DNA進(jìn)行變性(方法包括酸解，熱解，酶解等)，變性后DNA單鏈上的BrdU才能與BrdU抗體結(jié)合，因此做BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)一定要變性，且變性程度也很重要。

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EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，是另一個(gè)能代替胸腺嘧啶（T）合成DNA的物質(zhì)。 EdU能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA分子中，通過EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)能快速檢測(cè)細(xì)胞DNA復(fù)制活性，適用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、DNA修復(fù)、細(xì)胞標(biāo)記示蹤等方面的研究。 EdU是BrdU的升級(jí)，EdU檢測(cè)染料只有BrdU抗體大小的1/500，在細(xì)胞內(nèi)很容易擴(kuò)散，無需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可快速有效檢測(cè)，可有效避免樣品損傷，在細(xì)胞和組織水平能更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖等現(xiàn)象。

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CFSE檢測(cè)法?

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羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有能與細(xì)胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團(tuán)和非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團(tuán)，使得CE成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物。 CFSE進(jìn)入細(xì)胞后與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，CFSE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半。利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測(cè)通道可檢測(cè)一個(gè)增殖細(xì)胞群中，各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度并對(duì)其進(jìn)行分析。

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刃天青還原法?

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刃天青是氧化還原反應(yīng)的指示劑，活細(xì)胞能夠?qū)⑷刑烨噢D(zhuǎn)化為一種熒光產(chǎn)物——試鹵靈，而不具有活力的細(xì)胞會(huì)很快喪失新陳代謝能力，則不能產(chǎn)生熒光信號(hào)。在560nm激發(fā)，590nm讀取熒光信號(hào)，熒光信號(hào)與細(xì)胞活力成正比。一般作為檢查牛乳中微生物質(zhì)量的指示劑。

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活細(xì)胞蛋白酶底物法/ATP法?

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活細(xì)胞蛋白酶是細(xì)胞活力的標(biāo)志物，只存在于活細(xì)胞內(nèi)，一旦細(xì)胞膜發(fā)生破損，酶活力立即消失。，現(xiàn)有各類試劑盒（如CellTiter-Fluor? Cell Viability Assay類試劑盒），大致的原理都是利用熒光基團(tuán)標(biāo)記的細(xì)胞蛋白酶的底物，可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。底物上的熒光基團(tuán)可以被細(xì)胞內(nèi)的酶切割釋放出來，受到激發(fā)，產(chǎn)生與活細(xì)胞數(shù)量成正比的熒光。

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ATP 是活細(xì)胞新陳代謝的重要指標(biāo)，CellTiter-Glo? Luminescent Cell Viability Assay試劑盒是利用ATP能參與試劑盒提供的底物和熒光素酶反應(yīng)的原理，在ATP的參與下產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度和ATP呈正相關(guān)?？捎糜诙繖z測(cè)細(xì)胞或者線粒體ATP的含量。

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看了上面還不知道做那種，別著急，帶著文獻(xiàn)和樣品，找生物實(shí)驗(yàn)菌，咱一步步來溝通確認(rèn)。?

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關(guān)于細(xì)胞活性檢測(cè)，今天就分享到這里。如果內(nèi)容對(duì)你有幫助，希望大家不要吝嗇點(diǎn)個(gè)贊哦，我們會(huì)繼續(xù)給大家輸出更多優(yōu)質(zhì)內(nèi)容~

最后，祝大家科研順利！如果你想了解更多關(guān)于細(xì)胞活性的知識(shí)，可以掃碼關(guān)注下哦~