RKO細胞是由 Michael Brattain 開發(fā)的一個低分化的結(jié)腸癌細胞系，它含有野生型P53，但缺乏人甲狀腺受體核受體(h-TR beta 1)。RKO細胞系是RKO-E6和RKO-AS45-1的親本細胞系，它的P53蛋白水平高于RKO-E6細胞。 該細胞系可以在裸鼠中成瘤，也可在軟瓊脂中形成集落。目前RKO細胞不僅被廣泛應(yīng)用于分子、細胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細胞系研究、DNA，RNA和遺傳學(xué)研究等，還可應(yīng)用于當(dāng)今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等，具有十分廣闊的市場前景。源井生物提供、活力強、狀態(tài)好的野生型RKO細胞，并能適用于各類基因編輯實驗，便于構(gòu)建各類RKO細胞模型，如基因敲除、敲入、點突變或穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建。

具體應(yīng)用

1.?用于癌癥研究，可以驗證由細胞株研究獲得的結(jié)果；

2.?預(yù)測個體樣本的反應(yīng)和排斥性，從而選擇最有效的抗癌藥物；

3.?篩選最具選擇性或毒性的新藥化合物；

4.?作為識別靶標(biāo)進行抗腫瘤藥物篩選與模型建立等。

CRISPR/Cas9技術(shù)在RKO細胞中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)正在改變許多生物醫(yī)學(xué)研究前景，包括癌癥研究。通過靈活的可編程性和誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，實現(xiàn)了在體外或體內(nèi)將癌癥突變引入細胞。然而，并非所有突變對腫瘤的發(fā)生都有同樣的作用，區(qū)分腫瘤生長和存活的基本突變和生物惰性突變是很麻煩的。Sayed等人提出了一種在RKO細胞中篩選高通量突變的功能相關(guān)性的方法。他們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)探測結(jié)直腸癌細胞系中的癌癥脆弱性, 使用正篩或負篩從整個集合群體中分離具有特定表型變化的細胞，來嘗試識別新的癌癥驅(qū)動突變。他們設(shè)計了100個高質(zhì)量的sgRNAs，這些sgRNAs能夠特異性切割RKO細胞中存在的突變。然后生成一個包含這些sgRNAs的多功能慢病毒文庫，并用于聯(lián)合篩選，以探測這些突變可能的生長條件。收集不同時間點的基因組DNA，PCR擴增、純化sgRNA，并通過深度測序定量sgRNA計數(shù)。分析結(jié)果顯示，在RKO細胞中，兩個靶向相同突變的sgRNAs(UTP14A：S99delS)將隨著時間的推移而耗盡（圖1A）。實驗結(jié)果證實，該突變的失活損害了細胞生長，因此Sayed等人認為UTP14A：S99delS是RKO細胞中的驅(qū)動突變(圖1B)。上述的研究結(jié)果表明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)能實現(xiàn)在功能上大規(guī)模分離癌癥突變，這顯然對未來癌癥的研究和治療提供了有效的幫助[2]。源井生物已以CRISPR/Cas9技術(shù)為基礎(chǔ)研發(fā)了獨家CRISPR-U?技術(shù)專利，CRISPR-U?技術(shù)具有更高效的基因切割效率，能提高至少10倍的基因編輯效率。目前源井生物向全球提供CRISPR-U?技術(shù)服務(wù)，包括基因敲除/點突變/敲入細胞株、基因編輯載體構(gòu)建、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株等等。

RKO細胞中基因編輯的具體案例

RKO 細胞中DIP2C 的缺失在研究人類癌癥中的作用

Disco-Interacting Protein 2 Homolog C?（DIP2C），是一種在人體組織和成人腫瘤中高水平表達的非特征基因，在外顯子組范圍內(nèi)的激素突變分析中被確定為推定的癌癥基因。為了研究DIP2C失活在人類癌癥中的作用并確定受該基因活性影響的過程，Larsson等人利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了人類DIP2C敲除RKO細胞系。結(jié)果顯示，RKO 細胞中DIP2C 的敲除會導(dǎo)致細胞增大和生長遲緩。并且Larsson等人揭示了表達水平會受到DIP2C缺失影響的780 個基因，包括編碼CDKN2A基因的腫瘤抑制基因、編碼上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)調(diào)節(jié)因子的ZEB1以及編碼乳腺癌干細胞的CD44和CD24等等。DNA 甲基化分析顯示超過30,000個基因位點受差異甲基化影響，其中大部分在DIP2C缺失后發(fā)生低甲基化。，而啟動子區(qū)域?DNA 甲基化的變化與基因表達的變化密切相關(guān)。DIP2C敲除后的RKO細胞具有更高的創(chuàng)傷閉合容量，所以DIP2C的缺失將會觸發(fā)癌細胞中大量的DNA甲基化和基因表達變化、細胞衰老和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[1]。

篩選最具耐藥性的因子，推進抑制劑的研發(fā)進程

壞死的細胞死亡途徑是人類病原體防御的一個關(guān)鍵組成部分，在組織穩(wěn)態(tài)過程中可以被異常抑制，從而導(dǎo)致多種類型的組織損傷和疾病。雖然含有RIPK1、RIPK3和MLKL的壞死體激酶信號復(fù)合物的形成機制已被熟知，但其調(diào)控和效應(yīng)功能的其他機制仍然有待發(fā)現(xiàn)。Callow等人通過CRISPR/Cas9進行了全基因敲除篩選了19,883個小鼠蛋白編碼基因，并且通過大規(guī)模轉(zhuǎn)導(dǎo) RKO 細胞獲得的 sgRNA 參考文庫，篩選出對細胞壞死具有耐藥性的因子，然后鑒定了112個壞死調(diào)控因子和介質(zhì)，包括59個新的候選通路成分，發(fā)現(xiàn)在沒有壞死誘導(dǎo)的情況下細胞生長基本不會受到任何影響。他們還進一步表明了一些組織特異性或應(yīng)激反應(yīng)途徑可能會通過調(diào)節(jié)RIPK1來防止受調(diào)控的細胞死亡。上述研究結(jié)果表明，對RIPK1功能的進一步探索對于推進了新的治療干預(yù)策略或臨床抑制劑的開發(fā)
[3]具有重要作用。

全基因組敲除后的RKO 細胞對于放療CRC提供了至關(guān)重要的幫助

結(jié)直腸癌?(CRC) 在最常診斷的癌癥中排名前三，并且是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。除了手術(shù)切除和化療，放療的佐劑也起著關(guān)鍵作用，可以延長患者的生存率。然而在放療過程中約有50%的患者會對放療佐劑產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致療效不理想、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，確定放射抗性的潛在機制，可以改善結(jié)直腸癌患者的治療結(jié)果。Yu等人通過在RKO結(jié)直腸癌細胞系進行基因組規(guī)模的CRISPR 敲除篩選，并結(jié)合?NGS 測序，以探索涉及結(jié)直腸癌放射抗性的調(diào)節(jié)因素，最終得到了3個候選基因。他們發(fā)現(xiàn)microRNA-5197-5p（miR-5197）可以顯著增強IR對RKO的細胞毒性。Yu等人通過進一步的機制研究，證明了miR-5197 直接靶向 CDK6 并抑制其在 RKO 細胞中的表達，可以誘導(dǎo)細胞周期停滯在?G1/S 期并抑制細胞分裂，因此，miR-5197 增強了放射敏感性。研究結(jié)果表明，miR-5197 可能是調(diào)節(jié) CRC 細胞放射敏感性的關(guān)鍵因素，并為開發(fā)對 IR 具有抗性的 CRC 患者的治療策略提供了幫助[4]。

源井生物目前已憑借CRISPR-U?技術(shù)專利自身更高效的切割效率成功在包括RKO細胞的超100多種細胞中成功建立了各類細胞模型，并成功敲除了超5000種基因，為全球不同地區(qū)的科研人員提供了一定的幫助?，F(xiàn)在源井生物的細胞基因編輯服務(wù)正在進行活動大促，價格優(yōu)惠，歡迎在線咨詢！

參考文獻

[1] Larsson, Chatarina, et al. "Loss of DIP2C in RKO cells stimulates changes in DNA methylation and epithelial-mesenchymal transition." BMC cancer 17.1 (2017): 1-12.

[2] Sayed, Shady, et al. "CRISPR/Cas9 as a tool to dissect cancer mutations." Methods 164 (2019): 36-48.

[3] Callow, Marinella G., et al. "CRISPR whole-genome screening identifies new necroptosis regulators and RIPK1 alternative splicing." Cell death & disease 9.3 (2018): 1-13.

[4] Yu, Shijun, et al. "A Genome-Scale CRISPR Knock-Out Screen Identifies MicroRNA-5197-5p as a Promising Radiosensitive Biomarker in Colorectal Cancer." Frontiers in Oncology (2021): 3050.