來(lái)源：“六扇門study”公眾號(hào)

本期分享的內(nèi)容來(lái)自3月CBIFS大會(huì)上福建省疾病預(yù)防控制中心馬群飛老師分享的《GB4789.2?菌落總數(shù)測(cè)定方法驗(yàn)證》報(bào)告，馬老師在報(bào)告中分享了許多關(guān)于“菌落總數(shù)測(cè)定中的誤操作及避免方法”，小六印象深刻，拿著本本做了許多記錄，馬上分享給小伙伴們哈！

菌落總數(shù)測(cè)定的影響因素較多，在操作過(guò)程中，出現(xiàn)的細(xì)微變化都可能影響最終計(jì)數(shù)結(jié)果。所以，檢驗(yàn)者準(zhǔn)確執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的工作能力非常重要，這樣可以將許多誤差減少到最低限度。

我們操作過(guò)程需要考慮的因素有哪些？

1、技術(shù)問(wèn)題
如：環(huán)境條件要求、解凍化凍方式、樣品處理方式、平皿堆疊層數(shù)、菌落數(shù)量異常、菌落蔓延干擾、顆粒干擾計(jì)數(shù)等。

2、管理問(wèn)題
如：不確定度評(píng)定、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用、培養(yǎng)基的驗(yàn)收、檢畢物品廢棄、其他標(biāo)準(zhǔn)方法、方法驗(yàn)證確認(rèn)、質(zhì)量控制頻次等。

3、報(bào)告方式
如：執(zhí)行方法標(biāo)準(zhǔn)、超出常規(guī)精度、報(bào)告符合規(guī)定。

接下來(lái)，小六重點(diǎn)分享馬老師在報(bào)告中提出需要關(guān)注的幾點(diǎn)內(nèi)容。

特別注意點(diǎn)解析

加樣混勻方式

重點(diǎn)關(guān)注培養(yǎng)皿開(kāi)啟、瓊脂恒溫、搖勻方式、培養(yǎng)基量、水平放置等是否符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。
例如，平皿要水平放置，因?yàn)榭赡芎罄m(xù)計(jì)數(shù)使用的是半個(gè)平板來(lái)計(jì)數(shù)（如有蔓延菌生長(zhǎng)），所以要水平放置凝固。

培養(yǎng)條件要搞清楚

6.2.1?水平放置待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h±2 h。水產(chǎn)品30 ℃±1 ℃培養(yǎng)72 h±3 h……
重點(diǎn)來(lái)了，許多小伙伴搞不清楚水產(chǎn)品和水產(chǎn)制品的區(qū)別哦，一定要準(zhǔn)確判斷類別，避免法律糾紛。

GB 10136-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-動(dòng)物性水產(chǎn)制品》中規(guī)定，以鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)相應(yīng)工藝加工制成的水產(chǎn)制品稱為動(dòng)物性水產(chǎn)制品。
由此可見(jiàn)，水產(chǎn)品和水產(chǎn)制品是不同的概念。

GB4789.2-2022中涉及的水產(chǎn)品應(yīng)為帶有原生菌群的未經(jīng)加工的水產(chǎn)品，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)72 h±3 h；而水產(chǎn)制品的培養(yǎng)條件是36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h±2 h。

稀釋度問(wèn)題

使用單個(gè)稀釋度，僅限于對(duì)這個(gè)樣品的微生物狀態(tài)和防腐劑、抑菌物質(zhì)等狀態(tài)，有足夠的把握時(shí)候才可以用！
例如：含有抑菌成分的產(chǎn)品在一定稀釋度范圍內(nèi)，會(huì)因?yàn)橐志煞譂舛鹊南陆?，使得微生物的生長(zhǎng)繁殖不再受到干擾，從而表現(xiàn)出“越稀釋菌越多”的現(xiàn)象。這類產(chǎn)品需要做多個(gè)稀釋度來(lái)獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。

產(chǎn)品中的微生物數(shù)量是一定的，因此在某個(gè)稀釋度下計(jì)數(shù)結(jié)果會(huì)達(dá)到峰值，隨后下降。此時(shí)峰值所對(duì)應(yīng)的稀釋度以下的濃度梯度就可以認(rèn)為是正常生長(zhǎng)的稀釋度，在該區(qū)間內(nèi)進(jìn)行產(chǎn)品的菌落總數(shù)測(cè)試即可。

檢驗(yàn)環(huán)境的要求不可忽視

食品樣品檢驗(yàn)應(yīng)在潔凈區(qū)域進(jìn)行，潔凈區(qū)域應(yīng)有明顯標(biāo)示。
無(wú)菌效果應(yīng)至少每?jī)芍茯?yàn)證一次。
美國(guó)FDA要求微生物檢驗(yàn)-工作臺(tái)面亮度足夠，操作時(shí)，同時(shí)測(cè)定工作區(qū)空氣沉降菌（15 min暴露，菌落數(shù)不能大于15 CFU/皿）。

自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)備的應(yīng)用
降低實(shí)驗(yàn)誤差，提高效率

微生物檢驗(yàn)自動(dòng)化的實(shí)現(xiàn)，能夠顯著增加日檢樣數(shù)量，大大減少了操作污染和判讀誤差，直接提升了方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性，同時(shí)，縮短檢驗(yàn)周期，降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)，并使檢驗(yàn)結(jié)果能夠真正實(shí)現(xiàn)全程記錄和過(guò)程追蹤，質(zhì)量控制有據(jù)可查。

平板計(jì)數(shù)瓊脂傾注溫度如何
保持在46℃~50℃？

按GB4789.2-2022的要求，平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注時(shí)的溫度應(yīng)保持在46℃~50℃（可放置于４８℃±２℃恒溫 裝置中保溫），由于過(guò)高的溫度會(huì)造成微生物的熱損傷，而過(guò)低的溫度又會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基過(guò)快凝固，影響傾注效果和計(jì)數(shù)，因此建議用恒溫裝置（如恒溫水浴鍋等）保持培養(yǎng)基的溫度。

按GB 4789.2-2022的要求“可將培養(yǎng)基放置于48℃±?2℃恒溫裝置中保溫”，注意靠空氣傳熱的培養(yǎng)裝置都不能用，恒溫裝置溫度設(shè)置為48℃為佳。
（如果我們恒溫箱設(shè)定了50℃，會(huì)出現(xiàn)±1℃偏差允許，51℃可能就超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了，設(shè)定為48℃為佳。）

此外，CNAS-CL01-A001-2022中提到，對(duì)結(jié)果有重要影響的儀器的關(guān)鍵量或值，應(yīng)納入設(shè)備的校準(zhǔn)/檢定計(jì)劃；如果溫度直接影響分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)監(jiān)控這類設(shè)備的運(yùn)行溫度。傾倒時(shí)培養(yǎng)基的溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，因此建議定期對(duì)恒溫裝置定期進(jìn)行校準(zhǔn)。

正確使用培養(yǎng)箱很重要

如果采用隔水式的恒溫培養(yǎng)箱，不能直接將平板放在培養(yǎng)箱底層。因?yàn)榈讓訙囟仁歉哂谠O(shè)定空氣溫度的（工作原理是靠加熱使空氣變熱）。

ISO7218?食品和動(dòng)物飼料的微生物學(xué) 微生物學(xué)檢驗(yàn)的通用規(guī)則規(guī)定，平板疊放不超過(guò)6塊！

如果使用測(cè)試片需要注意什么？

如果使用菌落總數(shù)測(cè)試片，并建議補(bǔ)充作業(yè)指導(dǎo)書(shū)。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)需要識(shí)別該方法是否能被檢驗(yàn)人員直接使用，當(dāng)其內(nèi)容不便理解，規(guī)定不夠簡(jiǎn)明或缺少相關(guān)信息，方法中有可選擇的步驟時(shí)，應(yīng)編制作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，以確保檢驗(yàn)人員使用該方法的一致性。
如：編制技術(shù)性驗(yàn)收操作細(xì)則，填寫(xiě)技術(shù)性驗(yàn)收原始記錄，證明測(cè)試片定量結(jié)果準(zhǔn)確（使用定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者用其他實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控手段證明）。

作業(yè)指導(dǎo)書(shū)里還需要包括什么情況下使用測(cè)試片方法。因?yàn)榘凑誄NAS要求，如果用戶未指定方法，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，并通知用戶?/p>

如何應(yīng)對(duì)菌落蔓延情況？????

GB4789.2-2022刪除了“報(bào)告菌落蔓延”的條款，但一些含有芽胞菌、銅綠假單胞菌的樣品，無(wú)法避免菌落蔓延。以下幾點(diǎn)操作檢驗(yàn)，或許有幫助：
（1）加樣后，要盡快傾注瓊脂，傾注后，不要急于封蓋，否則容易形成水汽，凝固后，再次覆蓋一層瓊脂；
（2）這類樣本也可以選擇用測(cè)試片，使用添加TTC的菌落總數(shù)測(cè)試片，可以抑制大多數(shù)菌落的蔓延，有助于觀察計(jì)數(shù)；但少數(shù)微生物，如部分芽胞桿菌等可能液化凝膠，形成擴(kuò)散的菌落，導(dǎo)致無(wú)法正常計(jì)數(shù)，選擇產(chǎn)品之前要多進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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