? ? ? ? 強光使人閉眼、花香使人愉悅、美食使人垂涎三尺、黑暗使人心跳加速……在人體的深處，細胞的表面，存在著大量能感知外界信號的G蛋白偶聯(lián)受體（Gprotein-coupled receptor, GPCR），它們參與調(diào)節(jié)人類生命活動的方方面面。

????????GPCR是一類具有7次跨膜螺旋的膜蛋白受體，有非常保守的空間結(jié)構，其起始端位于細胞膜外側(cè)，而末端位于細胞內(nèi)側(cè)（圖1）。配體與跨膜螺旋組成的“口袋”進行結(jié)合，通過跨膜構象的變化，將信息傳遞到細胞內(nèi)。配體的性質(zhì)決定GPCR的狀態(tài)，起激活作用的配體（激動劑）使受體活化，受體進一步與G蛋白異源三聚體偶聯(lián)，將配體信號轉(zhuǎn)導進細胞內(nèi)；而起抑制作用的配體（抑制劑／拮抗劑）使原本活化的受體功能受到抑制。

在人體內(nèi)有超過800個GPCR家族成員，GPCR是最重要的現(xiàn)代藥物靶點家族，癌癥、糖尿病、心臟病、免疫和感染性疾病、神經(jīng)與精神疾病等疾病都與之相關，屬于藥物開發(fā)領域的“明星”。目前FDA批準的藥物中，約1/3是靶向GPCR的，但是涵蓋的GPCR靶點只有100多個，除去另外一半負責嗅覺的靶點，還剩下約300個GPCR潛在藥物開發(fā)靶點。對這些GPCR進行深入研究和篩選，未來有可能開發(fā)出更好的靶向藥物。2017年nuture上一篇關于GPCR藥物研發(fā)的長文中提到現(xiàn)成的GPCR藥物靶點均被10.3個不同的藥物靶向，這意味著已有靶點空間接近飽和，開發(fā)新藥需要發(fā)現(xiàn)新的能夠成藥的受體。該文前景與展望中都提到，未來GPCR藥物研發(fā)要解決的關鍵問題之一是需要改進疾病模型和借助如CRISPR/Cas9基因編輯技術[1]這樣的基因編輯系統(tǒng)來進行藥物靶標確認（target validation）。作為近年來最炙手可熱的基因編輯技術，CRISPR/Cas9與GPCR藥物靶點的研究與發(fā)展有哪些聯(lián)系呢？今天小源給大家介紹一些相關的應用案例。

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驗證GPRC6A是開發(fā)前列腺癌拮抗劑的潛在治療靶點

????????前列腺癌是最常見的癌癥之一，也是美國男性中癌癥相關死亡的第二大原因。雄激素去勢療法?(ADT)?是這種疾病的初始治療方法，但該疾病通常會發(fā)展為更具臨床侵襲性的去勢抵抗性前列腺癌?(CRPC)。因此需要進一步了解CRPC的分子發(fā)病機制和確定新的藥理學靶點以設計新的前列腺癌治療方法。GPRC6A?與前列腺癌的發(fā)病機制有關，但其作用仍不確定，研究人員通過使用CRISPR/Cas9技術創(chuàng)建的GPRC6A缺陷型PC-3細胞，與野生型PC-3細胞分別在基礎水平和配體刺激下細胞的增殖和遷移變化，結(jié)果表明敲除了GPRC6A的PC-3細胞中，可以顯著抑制ERK、AKT和mTOR信號通路的骨鈣素激活，以及抑制體外細胞增殖和遷移。且體內(nèi)異種移植模型中，GPRC6A敲除的細胞相比野生型PC-3細胞，腫瘤生長明顯減小，表明對骨鈣素誘導的前列腺癌的生長具有抵抗性。研究結(jié)果支持GPRC6A和骨鈣素在前列腺癌中的作用，并確定了抑制前列腺癌的潛在治療靶點[2]。

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通過基因編輯對GIPR/GLP-1R雙激動劑的不同受體進行活性驗證

????????在攝入營養(yǎng)物質(zhì)后，腸內(nèi)L細胞和K細胞分別分泌胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)和葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)，這些“腸促胰島素”通過增加胰腺β細胞的葡萄糖刺激胰島素分泌(GSIS)降低血糖水平。這就確立了GLP-1R和GIPR這兩個受體作為糖尿病治療的重要藥物靶點，研究表明GLP-1和GIP聯(lián)合使用可以產(chǎn)生有益的效果，但由于兩種受體的下游信號通路有重疊，在開發(fā)潛在的新療法時，需要確定雙激動劑在每個受體上的相對活性。研究人員通過在INS-1?胰腺β細胞系中，利用CRISPR/Cas9技術分別靶向GIP?受體?(GIPR)?和?GLP-1?受體?(GLP1R)?，成功獲得GIPR-KO和GLP1R-KO克隆。并將獲得的細胞系用于測試不同雙激動劑的活性。雙激動劑A在野生型INS-1細胞和GIPR-KO細胞中檢測到相當?shù)男ЯΓ贕LP1R-KO細胞中效力低了20倍，表明GLP-1在雙激動劑A中貢獻更大，雙激動劑B的結(jié)果則是GIP成分更顯著，平衡雙激動劑C在體外和體內(nèi)均參與GLP-1R和GIPR。這是CRISPR/ Cas9技術首次被用于檢測體內(nèi)GLP-1R/GIPR雙激動劑活性，不僅如此，該技術還可以應用于β細胞和其他相關細胞系中許多其他共表達靶點[3]的研究。

對經(jīng)典的β2AR靶點用遺傳方法進行驗證，補充強有力的藥理學證據(jù)

????????β 腎上腺素能受體?(βAR)?是一種G蛋白偶聯(lián)受體，對于在神經(jīng)系統(tǒng)和全身中發(fā)現(xiàn)的激素/神經(jīng)遞質(zhì)腎上腺素和去甲腎上腺素的生理反應至關重要，是許多被廣泛使用的藥物的靶標，其中研究最廣泛的是βAR和β2AR，其配體用于哮喘和心血管疾病治療。βARs通過Gαs G蛋白和通過激活腺苷酸環(huán)化酶和?cAMP?依賴性蛋白激酶發(fā)出信號，為了給β2AR在Ca2+釋放過程的作用補充強有力藥理學證據(jù)，研究人員在基因?qū)用鎸ζ溥M行了研究。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)創(chuàng)建ADRB2基因缺失的HEK293細胞，用對照載體或表達HA-β2AR的構建體分別轉(zhuǎn)染該敲除系并測試其對ISO的Ca?2+反應，結(jié)果表明在不存在β2AR?的情況下，細胞中沒有可檢測到對ISO?的?Ca?2+響應，在高得多的濃度下僅觀察到非常微弱的非特異性反應，轉(zhuǎn)染β2AR的表達質(zhì)粒可以對其進行挽救[4]。

?基因編輯技術應用于GPCR研究的案例還有很多，比如通過GPCR的sgRNA敲除文庫負向篩選促進病毒感染的基因，又如通過CRISPR/Cas9技術在感興趣的GPCR基因上打上一個標簽。Horioka等人[5]在HEK293細胞CXCR4基因N端敲入NLuc的一個片段—LgBiT (an 18-kDa protein)，同時在β-arrestin2的C端敲入了NLuc的另一個片段-SmBiT (an 11-amino-acid-residue peptide)，兩者靠近后可以發(fā)出熒光，用于篩選CXCR4的激動劑配體。

GPCR家族仍有許多秘密未被我們探知，在藥物靶點研發(fā)方面有著巨大潛力，有望為各大疾病治療提供新希望。而隨著CRISPR/Cas9技術的發(fā)展，我們可以借助其更快捷地獲得細胞模型以研究GPCR、進行藥物靶點驗證及高通量篩選，加快GPCR開發(fā)步伐！

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[1] Hauser A S, Attwood M M, Rask-Andersen M, et al. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications[J]. Nature reviews Drug discovery, 2017, 16(12): 829-842.

[2]?Ye R, Pi M, Cox J V, et al. CRISPR/Cas9 targeting of GPRC6A suppresses prostate cancer tumorigenesis in a human xenograft model[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2017, 36(1): 1-13.

[3] Naylor J, Suckow A T, Seth A, et al. Use of CRISPR/Cas9-engineered INS-1 pancreatic?β?cells to define the pharmacology of dual GIPR/GLP-1R agonists[J]. Biochemical Journal, 2016, 473(18): 2881-2891.

[4]Galaz-Montoya M, Wright S J, Rodriguez G J, et al.?β2-Adrenergic receptor activation mobilizes intracellular calcium via a non-canonical cAMP-independent signaling pathway[J]. Journal of Biological Chemistry, 2017, 292(24): 9967-9974.

[5]Horioka M, Huber T, Sakmar T P. Playing Tag with Your Favorite GPCR Using CRISPR[J]. Cell Chemical Biology, 2020, 27(6): 642-644.