眼睛是感知光線的器官，光投射到對光敏感的視網(wǎng)膜上，視網(wǎng)膜接收并轉(zhuǎn)化成信號通過視神經(jīng)傳遞到腦部。

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圖1 眼睛結(jié)構(gòu)

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遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良和視神經(jīng)病變可導(dǎo)致視覺功能的慢性致殘性喪失，而aav是治療遺傳性眼病最有前景的工具之一[1]。根據(jù)治療目的不同，AAV遞送到體內(nèi)的方式不同，有玻璃體腔注射、視網(wǎng)膜下腔注射、前房注射、角膜基質(zhì)注射等，其中較常用的是玻璃體腔注射（IVT）和視網(wǎng)膜下注射（SR）。

玻璃體腔注射是將AAV直接注入眼球玻璃體腔內(nèi)，可靶向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)或穆勒膠質(zhì)細(xì)胞，但這種注射方法會觸發(fā)體液免疫反應(yīng)，阻礙再次注射時AAV表達(dá)，需要注射另一只眼睛時建議使用視網(wǎng)膜下腔注射。

視網(wǎng)膜下注射可靶向局部區(qū)域（例如黃斑），有利于將AAV遞送至視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）、光感受器和穆勒膠質(zhì)細(xì)胞。在嚙齒類動物中，玻璃體腔注射AAV可有效靶向神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，并將AAV擴(kuò)散至整個視網(wǎng)膜，但由于內(nèi)界膜的存在，靈長類動物中未見AAV擴(kuò)散[2]。

接下來小編將詳細(xì)介紹AAV靶向眼部的注射方式，注射方法后有附上教學(xué)視頻哦，小伙伴可以將視頻網(wǎng)址復(fù)制到瀏覽器中觀看學(xué)習(xí)~

玻璃體腔注射

1、麻醉：4.3% 水合氯醛 0.01 ml/g；

2、散瞳，建議雙眼散瞳，以防一眼出現(xiàn)意外時可以迅速換眼；

3、保持眼表濕潤；小鼠晶體非常敏感，溫度變化、麻醉藥物、眼壓以及眼表干燥等都會導(dǎo)致小鼠晶體混濁；當(dāng)然，這種混濁大概 2 小時以后恢復(fù)正常；

4、抗生素眼藥水、表麻藥術(shù)前滴眼；

5、調(diào)整小鼠頭位。小鼠的頭是三角形的，因此需要使用棉球或者其他墊一下頭部讓小鼠眼球保持角膜緣水平位；

6、注射位置：理論上是角膜緣后 1 mm，可以根據(jù)情況進(jìn)行調(diào)整；

7、注射切口：推薦小鼠可以用 ALCON 的 10-0 針做切口，非常整齊，33 G 的針進(jìn)去水密非常好。也可以用破囊針。切口越整齊，跟你的針越匹配，越不易滲漏；

8、進(jìn)針：針尖垂直進(jìn)入，隨后傾斜。這一步非常重要，小鼠眼球小，晶體球形，傾斜角度小了會損傷晶體，大了會扎上視網(wǎng)膜，出血；

9、注射：緩慢推注。要是迅速推注你取材時會發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜散在出血點，可能干擾試驗結(jié)果。推針以后留針 0.5-1 min，迅速出針。

視頻教程：https://mp.weixin.qq.com/s/LLeTMwQTO_Olue5_owupRA

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視網(wǎng)膜下腔注射[3]

1、麻醉：對于成年小鼠，異氟醚吸入麻醉或聯(lián)合使用氯胺酮（100mg/ml）和賽拉嗪(20mg/ml)按照0.1ml/10g腹腔注射; 對于圍產(chǎn)期小鼠，異氟烷吸入麻醉或低溫麻醉；

2、使用Vannas直剪沿著閉合的眼瞼裂開大約1.5 mm的切口；注意切口不要太大；

3、用彎曲的敷料鉗將眼皮分開，以支撐眼睛，并在眼睛下方稍微捏緊眼皮，將其拿起以供注射；

4、在眼球中緯線或中緯線后方做一個小的鞏膜切口，切口夠注射針尖端通過即可；

5、小心地將注射針插入切口部位，并平行于眼外壁進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔；

6、開始注射，如果正確注射至視網(wǎng)膜下腔，能感受到適度的阻力；緩慢出針，可將針頭固定15s，避免注射病毒回流到切口位置；

7、使用彎曲的敷料鉗輕輕地將眼睛推回眼眶；將適量0.25%布比卡因，滴在注射部位；

8、小鼠蘇醒后置于加熱墊上，整個注射過程控制在5min內(nèi)完成；

9、小鼠恢復(fù)活動能力后放回鼠籠。

視頻教程：https://www.jove.com/cn/v/55894/ultrahigh-resolution-mouse-optical-coherence-tomography-to-aid

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有研究表明AAV2、AAV5、AAV8、AAV9等血清型可有效感染視網(wǎng)膜，AAV8、AAV9和AAV5感染視錐細(xì)胞的效率高于AAV2[4-6]。除以上常見血清型外，漢恒生物還可以提供AAV-DJ、AAV-GL、AAV-NN和AAV-shH10靶向視網(wǎng)膜的特異性血清型以及rpe65（視網(wǎng)膜）、ARrr3（視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞）、hrk（視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞）特異性啟動子。更多關(guān)于AAV在眼部注射方法的問題歡迎咨詢漢恒生物！

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參考文獻(xiàn)

[1]?Sch?n, Christian, Biel, Martin, Michalakis, Stylianos.?Retinal gene delivery by adeno-associated virus (AAV) vectors: Strategies and applications. European Journal of Pharmaceutics & Biopharmaceutics, 2015, 95:343-352.

[2]?Buck T M?, Wijnholds J.?Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors (rAAV)-Vector Elements in Ocular Gene Therapy Clinical Trials and Transgene Expression and Bioactivity Assays[J].International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(4197):4197.

[3]?Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease[J].Nature Protocols[2023-06-16].

[4]?Vandenberghe L H , Peter B , Maguire A M ,et al.AAV9 Targets Cone Photoreceptors in the Nonhuman Primate Retina[J].Plos One, 2013, 8(1):e53463.

[5]?Ramachandran P S , Lee V , Wei Z ,et al.Evaluation of dose and safety of AAV7m8 and AAV8BP2 in the non-human primate retina[J].Human Gene Therapy, 2016, 28(2).

[6]?Boye S E , Alexander J J , Boye S L ,et al.The human rhodopsin kinase promoter in an AAV5 vector confers rod- and cone-specific expression in the primate retina.[J].Human Gene Therapy, 2012, 23(10):1101-15.