棕色脂肪組織（BAT）是非顫抖產(chǎn)熱（NST）的主要部位，NST可保護哺乳動物免受低溫的傷害。NST在動物暴露于寒冷環(huán)境時顯著增加，并由BAT內(nèi)的線粒體解偶聯(lián)介導(dǎo)，釋放能量以產(chǎn)生熱量。為了補充細胞內(nèi)的能量儲備，冷激活的BAT需要增加葡萄糖和脂肪酸的攝取作為燃料供應(yīng)以維持高水平的線粒體呼吸。然而，在這種體溫調(diào)節(jié)的挑戰(zhàn)下，BAT控制血糖穩(wěn)態(tài)的內(nèi)分泌功能知之甚少。

2023年9月6日，南京大學(xué)張辰宇教授團隊和劍橋大學(xué)Antonio Vidal-Puig教授團隊合作在《nature communications》（IF=17.694）發(fā)表了題為“Cold-activated brown fat-derived extracellular vesicle-miR-378a-3p stimulates hepatic gluconeogenesis in male mice”的研究論文，在此文章中，研究者們展示了在雄性小鼠中，BAT來源的細胞外囊泡（BDEVs）在冷應(yīng)激期間通過促進肝臟糖異生來重新編程系統(tǒng)的葡萄糖代謝。冷暴露有助于miR-378a-3p（一種大量存在于BAT中的miRNA）選擇性包裝到細胞外囊泡（EVs）中并遞送到肝臟中，通過靶向p110α促進糖異生。總之，作者證明了由寒冷誘導(dǎo)的含有miR-378a-3p的BDEV可以作為內(nèi)分泌信號分子在冷應(yīng)激下調(diào)節(jié)肝臟糖異生。值得注意的是，本文使用的分別特異性過表達或敲低BAT和肝臟中miR-378a-3p的AAV來自漢恒生物。

接下來，我們來看看研究結(jié)果：

首先，為了確定在寒冷環(huán)境下BAT是否刺激肝臟糖異生，作者將小鼠置于4℃環(huán)境下，小鼠體溫在早期下降，一段時間后，小鼠迅速適應(yīng)，體溫恢復(fù)到對照水平，表明產(chǎn)熱的激活，且UCP1等相關(guān)產(chǎn)熱基因的表達顯著升高，此外，寒冷顯著刺激了小鼠每日的食物攝入，同時體重降低，表明提高了代謝率以抵御寒冷。冷激活的BAT中，2-NBDG顯著升高以及更多的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白FLUT4易位到質(zhì)膜，說明冷暴露增加了BAT中的葡萄糖攝取，QPCR結(jié)果顯示，冷暴露的小鼠肝臟中的糖異生增加，AKT、FOXO1和GSK3β的磷酸化在肝臟中的冷暴露受到明顯抑制，表明冷暴露對BAT（葡萄糖攝取增加）和肝臟（糖異生增加）的葡萄糖代謝有協(xié)調(diào)作用。為了測試冷暴露對肝臟葡萄糖代謝的影響是否會直接受到BAT的影響，作者從小鼠身上切除了肩胛骨間棕色脂肪組織（iBAT），與假手術(shù)組相比，切除iBAT的小鼠早期的體溫下降更迅速，適應(yīng)溫度變得相對更慢，且iBAT切除沒有改變食物攝入量，同時糖異生基因表達水平降低，AKT、FOXO1和GSK3β的磷酸化明顯增加。綜上所述，冷激活的BAT可能促進肝糖異生來直接影響肝糖代謝。

圖1. BAT在冷暴露時刺激肝臟糖異生

由于有證據(jù)表明BAT還有內(nèi)分泌器官的功能，所以作者探究了BAT分泌的細胞外囊泡（EVs）是否也可能在這過程中發(fā)揮作用。作者將小鼠分別置于25℃（RT-BAT）和4℃（Cold-BAT）環(huán)境下，72h后分離BAT來源的EVs，分析顯示，Cold-BAT通常比RT-BAT表現(xiàn)出更多的EVs分泌，此外，EVs的標志基因的表達在Cold-BAT分泌的EVs中顯著增加。隨后，通過對BDEVs的可視化和追蹤，作者在體外和體內(nèi)分別驗證了冷暴露促進BDEVs的分泌并促進其輸送到肝臟。隨后，作者又探究了冷激活的BAT分泌的EVs是否可以作為內(nèi)分泌調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)肝糖代謝，作者分別將RT-BDEVs和Cold-BDEVs和原代肝細胞孵育48h，然后進行功能分析，與用RT-BDEVs孵育的細胞相比，用Cold-BDEVs孵育的細胞AKT的磷酸化水平顯著降低，同時糖異生基因的表達（Pgc-1α、G6Pase、Pepck）顯著增加。將RT-BDEVs和Cold-BDEVs靜脈注射到正常飼養(yǎng)的小鼠體內(nèi)，與RT-BDEVs組相比，Cold-BDEVs處理導(dǎo)致糖異生基因表達水平升高，磷酸化AKT，F(xiàn)OXO1和GSK3β水平降低，丙酮酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖的量增加。為了驗證Cold-BDEVs在調(diào)節(jié)糖異生方面的關(guān)鍵作用，作者使用EV分泌抑制劑GW4869阻斷寒冷誘導(dǎo)的BDEVs產(chǎn)生，在GW4869處理后，在小鼠肝臟中觀察到磷酸化AKT增加和糖異生基因減少。綜上說明冷刺激產(chǎn)生的BDEVs可以促進肝糖異生。

圖2. Cold-BDEVs增強了肝糖異生

越來越多的證據(jù)表明，細胞來源的EV含有許多miRNA，這些包裝在EV中的miRNA可以被受體細胞吸收以調(diào)節(jié)其功能，所以作者探究了BDEVs中是否也含有有助于寒冷誘導(dǎo)的肝糖異生的功能性miRNA。通過測序以及QPCR驗證，miR-378a-3p和miR-193b-3p被選為候選miRNA，然而，只有miR-378a-3p在暴露于寒冷的小鼠的BDEVs和血清EV中顯著上調(diào)，這表明miRNA被選擇性地包裝在活化的BDEVs中，因此，作者選擇了miR-378a-3p進行進一步研究。QPCR顯示，miR-378a-3p在冷暴露的小鼠iBAT中表達水平顯著升高。靜脈注射Cold-BDEVs的小鼠相比于注射RT-BDEVs的小鼠，miR-378a-3p的肝臟表達量升高更顯著，而在BAT中局部注射GW4869導(dǎo)致冷暴露的小鼠肝臟中miR-378a-3p水平顯著降低。此外，與對照組相比，BAT切除的小鼠在冷暴露后血清EVs和肝臟中表現(xiàn)出顯著較低的miR-378a-3p表達水平。這些結(jié)果表明，冷暴露時，BDEVs將miR-378a-3p輸送到肝臟中，導(dǎo)致肝臟miR-378a-3p升高。

圖3. 冷暴露會增加BDEVs中miR-378a-3p的表達

接下來，作者研究了miR-378a-3p在調(diào)節(jié)肝細胞葡萄糖代謝中的作用。用miR-378a-3p的模擬物轉(zhuǎn)染原代棕色脂肪細胞，收集BDEVs并與肝細胞一起孵育。與對照細胞相比，miR-378a-3p的過表達顯著誘導(dǎo)肝細胞中葡萄糖的產(chǎn)生，同時糖異生基因表達上調(diào)，肝細胞中p-AKT、p-FOXO1和p-GSK3β的蛋白質(zhì)水平降低。p110α是控制葡萄糖代謝的PI3K激酶的基本亞基，在先前的研究中被證明是miR-378a-3p的直接靶標。WB結(jié)果顯示，miR-378a-3p過表達顯著降低了肝細胞中p110α的蛋白水平，但沒有顯著改變總胰島素受體（IR）表達水平和IR的磷酸化水平。相反，用miR-378a-3p抑制劑處理肝細胞，發(fā)現(xiàn)p110α的蛋白水平升高，糖異生基因的表達下調(diào)。這些結(jié)果表明，BDEVs中的miR-378a-3p是促進肝細胞糖異生的重要信號分子。

然后，作者評估了含有miR-378a-3p的BDEVs在體內(nèi)環(huán)境中的作用。為了實現(xiàn)iBAT中miR-378a-3p的特異性過表達，作者使用了漢恒生物提供的FABP4特異性啟動子啟動的miR-378a-3p過表達AAV病毒（AAVFABP4-378a），通過原位多點注射，在感染病毒后28天，檢測到iBAT中miR-378a-3p的表達顯著增加，與對照組相比，過表達組的小鼠的血清EV和肝臟中miR-378a-3p的表達水平也增加，肝臟糖異生增加，同時p-AKT和p110α信號傳導(dǎo)降低，而總IR表達水平和IR的磷酸化水平不變，證實miR-378a-3p通過靶向肝臟中的p110α直接影響IR下游的因子?？傊?，這些數(shù)據(jù)證實了含有miR-378a-3p的BDEVs可以通過在體內(nèi)直接靶向肝臟p110α來促進糖異生。

圖4. miR-378a-3p在BAT中的過表達調(diào)節(jié)小鼠肝糖異生

為了研究miR-378a-3p在冷暴露期間調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)中的作用，作者使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)生成了miR-378a-KO小鼠模型（378KO），在RT條件下飼養(yǎng)的378KO小鼠的肝臟中檢測到p110α蛋白水平增加，但沒有檢測到體重或食物攝入的顯著變化，而血糖水平略有下降，而在冷暴露的378KO小鼠的肝臟中觀察到AKT磷酸化顯著增加，Pgc-1α、G6Pase和Pepck表達降低，表明冷誘導(dǎo)的肝臟糖異生受損。隨后作者利用AAVFABP4-378a通過多點注射恢復(fù)iBAT中的miR-378a-3p水平。miR-378a-3p在iBAT中的重新表達顯著升高了378KO小鼠肝臟中的G6Pase和Pepck，進一步證實了BAT來源的miR-378a-3p直接促進肝臟糖異生。

圖5. iBAT中miR-378a-3p的恢復(fù)挽救了miR-378 KO小鼠的肝糖異生

為了具體研究miR-378a-3p對寒冷誘導(dǎo)的肝糖異生的影響，作者使用了肝臟特異性啟動子啟動表達miR-378a-3p反義序列的AAV病毒（AAVTBG-sponge），尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，在感染后25天，將小鼠置于寒冷環(huán)境中72h，肝臟中miR-378a-3p的敲低導(dǎo)致p110α和p-AKT的蛋白質(zhì)水平顯著增加，同時G6Pase和Pepck，Pgc-1α的表達降低。為了直接證明iBAT中miR-378a-3p的特異性下調(diào)是否會影響寒冷誘導(dǎo)的肝糖異生，作者將AAVFABP4-sponge注射到iBAT中，感染后25天，小鼠在處死前冷暴露3天，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，感染AAVFABP4-sponge的小鼠BDEVs、血清EV和肝臟中的miR-378a-3p表達降低，而肝臟中miR-378a-3p的轉(zhuǎn)錄不受影響，表明BAT中miR-378a-3p下調(diào)導(dǎo)致分泌到肝臟中的miR-378-3p減少，而且iBAT中miR-378a的敲低增加了肝臟中p110α和p-AKT的蛋白質(zhì)水平，并抑制了肝臟糖異生基因的表達。

圖6. BAT中miR-378a-3p的下調(diào)抑制了寒冷誘導(dǎo)的肝糖異生

綜上所述，本研究表明，由寒冷激活的棕色脂肪分泌的富含miR-378a-3p的胞外囊泡刺激肝臟葡萄糖的產(chǎn)生，以維持全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)。研究結(jié)果通過確定BDEVs中miR-378a-3p 在冷應(yīng)激下調(diào)節(jié)肝糖代謝的作用，強調(diào)了BAT冷應(yīng)激下的內(nèi)分泌功能。