? ? ? ? 今天介紹的是正痘病毒(Orthopoxvirus)的經(jīng)典毒株——痘苗病毒(Vaccinia Virus/VACV/VV)。

簡介

? ? ? ? ?痘苗病毒（Vaccinia Virus、VACV或VV）是一種大型復(fù)雜的包膜病毒，屬于核質(zhì)大DNA病毒(Nucleo-Cytoplasmic Large DNA Virus)家族的正痘病毒(Orthopoxvirus)。它有一個線性雙鏈DNA基因組，長度為194711個堿基對(WR株)，可編碼約250個基因，末端重復(fù)序列(Terminal Repeat)的末端形成了末端環(huán)(Terminal Loop)。病毒體的尺寸約為360×270×250 nm，質(zhì)量約為5–10fg(1fg=10^-15g=10^-18kg)。

? ?? ? 由于十八世紀(jì)英國醫(yī)師和科學(xué)家愛德華·詹納（Edward Jenner）使用牛痘病毒進(jìn)行的開創(chuàng)性工作，天花是通過疫苗廣泛預(yù)防的第一種疾病。痘苗病毒是根除天花的疫苗的活性成分，天花病毒是第一種被根除的病毒。這項工作是由世界衛(wèi)生組織根除天花計劃進(jìn)行的。根除天花后，科學(xué)家繼續(xù)研究痘苗病毒，將其用作將基因傳遞到生物組織中的工具（基因治療和基因工程），并且作為同生物恐怖主義斗爭的最終手段。

痘苗病毒感染

? ? ? ? 除了初次接種疫苗，通過抓傷將感染轉(zhuǎn)移到其他部位以及接種疫苗后腦炎的發(fā)病率之外，接種疫苗的其他并發(fā)癥還可以分為以下幾種類型：

1.廣泛性痘苗疹

2.疫苗濕疹

3.漸進(jìn)性痘疹(壞疽型，壞死型)

4.玫瑰色痘疹

起源

? ? ? ? 痘苗病毒與引起牛痘的牛痘病毒密切相關(guān)。 從歷史上看，這兩個經(jīng)常被認(rèn)為是相同的。由于缺乏記錄保存，痘苗病毒的確切來源是未知的，因為該病毒在研究實驗室中經(jīng)過數(shù)十年的反復(fù)培養(yǎng)和傳播。最常見的觀念是痘苗病毒，痘苗病毒和天花病毒（天花的病原體）均源自常見的始祖病毒。 也有人猜測牛痘病毒最初是從馬匹中分離出來的，對早期（1902年）天花疫苗樣本中的DNA的分析表明，它與馬痘病毒的比例為99.7％。

病毒學(xué)特征

痘苗病毒的特征

? ? ? ? 以痘苗病毒為代表的痘病毒(Poxvirus)形狀非常特別，為特殊的磚狀(Brick Shape)，長360納米，寬270納米，高250納米。病毒dsDNA被核衣殼包裹成絲狀，絲狀核心被核壁包裹成磚狀體。磚狀體中央有兩個中央體(Latent Body)，這使得病毒中央形成兩個突起。

? ? ? ? ?有少數(shù)痘病毒的形狀為卵形(Oval Shape)。例如以口瘡病毒/奧爾夫病毒(Orf Virus)為代表的副痘病毒(Parapoxvirus)，口瘡病毒長300納米，寬220納米，高170納米，形狀與其說是卵形，不如說是三軸橢球體。

痘苗病毒生活史

? ? ? ? 痘苗病毒的宿主細(xì)胞與天花病毒一樣——輔助T細(xì)胞、調(diào)節(jié)T細(xì)胞、殺手T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞。但是與天花病毒不同，痘苗病毒感染癥狀輕微。

? ? ? ?這是以痘苗病毒為代表的痘病毒復(fù)制過程：

1.病毒蛋白與宿主糖胺聚糖(GAG)的連接介導(dǎo)病毒向宿主細(xì)胞內(nèi)吞。除此以外，病毒也可以通過模擬凋亡入侵細(xì)胞。

2.與細(xì)胞膜融合以將核心釋放到宿主細(xì)胞質(zhì)中。

3.早期階段：病毒RNA聚合酶將早期基因轉(zhuǎn)錄到細(xì)胞質(zhì)中。 早期表達(dá)在感染后30分鐘開始。

4.隨著早期表達(dá)的結(jié)束，核心完全沒有被覆，病毒基因組現(xiàn)在在細(xì)胞質(zhì)中自由。

5.中間階段：表達(dá)中間基因，在感染后大約100分鐘觸發(fā)基因組DNA復(fù)制。

6.晚期：感染后140分鐘至48小時表達(dá)晚期基因，產(chǎn)生所有結(jié)構(gòu)蛋白。

7.子代病毒體的組裝始于細(xì)胞質(zhì)病毒工廠，產(chǎn)生球形的未成熟顆粒。 該病毒顆粒成熟，成為磚狀的細(xì)胞內(nèi)成熟病毒體(IMV)。

8.IMV病毒體可以在細(xì)胞裂解后釋放，或者可以從高爾基體出芽，獲得第二個膜，作為外部包膜病毒體(EEV)。

? ? ? ?痘病毒在DNA病毒中是獨特的，因為它們僅在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，而不是在細(xì)胞核內(nèi)。因此，需要大基因組來編碼參與病毒DNA復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄的各種酶和蛋白質(zhì)。在其復(fù)制周期中，VV產(chǎn)生四種感染形式，它們的外膜不同：細(xì)胞內(nèi)成熟病毒體(IMV)，細(xì)胞內(nèi)包膜病毒體(IEV)，細(xì)胞相關(guān)包膜病毒體(CEV)和細(xì)胞外包膜病毒體(EEV)。 盡管問題仍然存在爭議，但普遍的觀點是IMV由單個脂蛋白膜組成，而CEV和EEV都被兩個膜層包圍，而IEV具有三個包膜。 IMV是最豐富的感染形式，被認(rèn)為是造成宿主之間傳播的原因。另一方面，據(jù)信CEV在細(xì)胞間傳播中發(fā)揮作用，而EEV被認(rèn)為對于宿主生物體內(nèi)的遠(yuǎn)距離傳播很重要。

? ? ? ?單層膜病毒通過細(xì)胞裂解釋放，雙層膜病毒通過出芽釋放。

痘病毒的DNA

? ? ? ? ?以痘苗病毒為主的痘病毒，擁有奇特的DNA復(fù)制方式。由于痘苗病毒DNA兩個末端各有一個末端環(huán)，因此痘苗病毒DNA復(fù)制主要圍繞DNA末端環(huán)進(jìn)行。

1.內(nèi)切酶在其中一個末端環(huán)末端制造一個切口

2.DNA聚合酶利用切口延伸DNA

3.解旋酶打開DNA雙鏈，末端環(huán)重新形成，作為DNA復(fù)制的引物

4.以末端環(huán)為引物，合成新的DNA

5.新DNA中央末端環(huán)受拓?fù)洚悩?gòu)酶的影響，形成一個泡泡(Bulge),泡泡成為形成Holliday交叉的關(guān)鍵步驟

6.泡泡形成十字結(jié)構(gòu)Holliday交叉

7.Holliday交叉，被內(nèi)切酶剪切

8.連接酶將DNA連接，形成兩個子代DNA

多重激活

? ? ? ? 痘苗病毒能夠經(jīng)歷多重激活(MR)。MR是一個過程，通過這個過程，兩個或多個不完整的病毒基因組在感染的細(xì)胞內(nèi)相互作用，形成了完整的病毒基因組。Abel發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單個病毒顆粒感染宿主雞胚細(xì)胞時，暴露于足以阻止子代形成的紫外線劑量的痘苗病毒下，當(dāng)宿主細(xì)胞被兩種或更多種滅活病毒感染時仍能產(chǎn)生存活的子代病毒。也就是說病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)可能會發(fā)生MR。Kim和Sharp證明了用紫外線、氮芥、X射線或伽馬射線滅活后的痘苗病毒MR。Michod等人回顧了許多不同病毒中MR的例子，并提出MR是病毒相互作用的一種常見形式，它提供了重組修復(fù)基因組損傷的優(yōu)勢。

宿主抵抗

? ? ? ? 痘苗病毒在其基因組中包含幾種蛋白質(zhì)的基因，這些蛋白質(zhì)賦予病毒對干擾素的抗性：

? ? ? ? K3L是一種與蛋白質(zhì)真核起始因子2(eIF-2alpha)具有同源性的蛋白質(zhì)。 K3L蛋白可抑制干擾素激活劑PKR的作用。

? ? ? ?E3L是痘苗病毒編碼的另一種蛋白質(zhì)。 E3L也抑制PKR激活； 并且還能夠結(jié)合雙鏈RNA。

疫苗應(yīng)用

? ? ? ? 痘苗病毒感染發(fā)病通常非常輕微，盡管可能引起皮疹和發(fā)燒，但通常不會對健康個體造成癥狀。痘苗病毒感染產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可以保護(hù)人免受致命的天花感染。由于這個原因，牛痘病毒過去一直被用作抗天花的活病毒疫苗。與使用弱化形式的疫苗進(jìn)行疫苗接種的疫苗不同，痘苗病毒疫苗不會引起天花感染，因為它不含天花病毒。但是，偶爾會出現(xiàn)某些并發(fā)癥或疫苗不良反應(yīng)。免疫功能低下的人會大大增加這種情況的發(fā)生。大約每百萬個人中就有一個會對疫苗產(chǎn)生致命的反應(yīng)。

? ? ? ? 當(dāng)前，僅向具有感染天花病毒高風(fēng)險的醫(yī)護(hù)人員或研究人員以及美國的軍事人員施用疫苗。由于天花病毒生物恐怖主義的威脅，將來可能必須再次廣泛接種這種疫苗。因此，科學(xué)家目前正在開發(fā)針對天花的新型疫苗策略，該策略在生物恐怖事件中更安全，部署速度更快。

? ? ? ? 2007年9月1日，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)了一種針對天花病毒的新型疫苗ACAM2000，可以根據(jù)需要快速生產(chǎn)。美國疾病控制與預(yù)防中心由賽諾菲·巴斯德(Sanofi Pasteur)制造，庫存了1億9250萬劑新疫苗。

? ? ? ? Imvanex是新研發(fā)的天花疫苗，它基于牛痘的改良株——改良的安卡拉痘苗病毒，于2013年獲得歐洲藥品管理局的批準(zhǔn)。

? ? ? ? 痘苗病毒也用于重組疫苗，作為在宿主內(nèi)表達(dá)外源基因的載體，以產(chǎn)生免疫反應(yīng)。其他痘病毒也被用作活重組疫苗。

歷史

? ? ? ? 天花病毒的最初疫苗和疫苗接種思想的起源是愛德華·詹納(Edward Jenner)在1798年描述的牛痘。牛痘的拉丁詞是Variolae vaccinae，該詞被詹納翻譯成“牛天花病毒”。這個詞的名字代表了整個疫苗接種的念頭。當(dāng)意識到天花疫苗中使用的病毒與牛痘病毒不再相同或不再相同時，天花疫苗中的病毒名稱為“痘苗”。 在冷藏運(yùn)輸方法發(fā)明之前，疫苗的效力和功效是不可靠的。該疫苗會因高溫和日光而變得無能為力，并且用干燥的方法將樣品干燥并運(yùn)送到需要的國家通常會導(dǎo)致疫苗失活。使用的另一種方法是“手臂到手臂”方法。這涉及給一個人接種疫苗，然后在感染性膿皰形成后立即將其轉(zhuǎn)移到另一個，然后轉(zhuǎn)移到另一個，等等。這種方法被用作疫苗的活體運(yùn)輸形式，通常使用孤兒作為攜帶者。但是，由于可能傳播其他血液疾病，例如肝炎和梅毒，這種方法存在問題。與1861年的情況一樣，當(dāng)時有41名意大利兒童通過“手臂到手臂”方法接種疫苗后感染了梅毒。

? ? ? ? 1913年，E.Steinhardt，C.Israel和R. A. Lambert在豬角膜組織培養(yǎng)的片段中生長了痘苗病毒。

? ? ? ? ?Willian Bulloch的學(xué)生Fredrick W. Twort在1915年發(fā)表的論文被認(rèn)為是現(xiàn)代噬菌體研究的開始。當(dāng)他注意到許多污染微球菌的菌落長大并出現(xiàn)粘液樣，水狀或玻璃狀時，他正嘗試在沒有活細(xì)胞的情況下在瓊脂培養(yǎng)基上生長痘苗病毒，并且可以通過接種新鮮菌落在其他菌落中誘導(dǎo)這種轉(zhuǎn)化。來自水殖民地的材料。他使用顯微鏡觀察到細(xì)菌已退化為小顆粒，并被Giensa染色染成紅色。他總結(jié)說：“……[它的轉(zhuǎn)化因子]幾乎可以被認(rèn)為是微球菌的急性傳染病?！?

? ? ? ? ?1939年，艾倫·瓦特·唐尼(Allan Watt Downie)表明，在20世紀(jì)使用的天花疫苗與痘苗病毒并不相同，但具有免疫學(xué)相關(guān)性。

最近的案例

? ? ? ? 2007年3月，一個2歲的印第安納州男孩和他的母親從男孩的父親那里感染了危及生命的痘苗病毒感染。這個男孩與父親密切接觸后，在其身上80％的身上出現(xiàn)了皮疹。父親在父親被天花疫苗接種后，被美國陸軍部署到海外。美國軍隊于2002年恢復(fù)了天花疫苗接種。該兒童因濕疹而獲得了感染，這是已知的痘苗病毒感染危險因素。該男孩接受了靜脈注射免疫球蛋白、西多福韋和Tecovirimat(ST-246)的治療，后者是由SIGA Technologies開發(fā)的一種實驗藥物。2007年4月19日，他被送回家，除了可能造成皮膚疤痕外，沒有任何后遺癥。

? ? ? ?2010年，疾病控制與預(yù)防中心（CDC）報告說，華盛頓的一名婦女與男友進(jìn)行了****接觸后感染了痘苗病毒，男友是一名軍人，她最近因天花病毒而接受了疫苗接種。該婦女有兒童濕疹病史，但成年后沒有癥狀。疾病預(yù)防控制中心表示，在與最近的一種軍用疫苗發(fā)生性接觸后，在過去的12個月中有4例類似的痘苗病毒感染病例。2012年，發(fā)生了更多病例，也有濕疹病史。

常見菌株

? ? ? ? 這是一些用于研究和疫苗接種的特性良好的牛痘菌株的列表。

李斯特(Lister，Elstree)：萊斯利·科利爾(Leslie Collier)使用的英國疫苗株，用于開發(fā)粉末狀的熱穩(wěn)定疫苗。在根除天花運(yùn)動(Smallpox Eradication Campaign，SEC)中用作疫苗生產(chǎn)的基礎(chǔ)

Dryvax(也稱為“惠氏”)：惠氏在美國先前使用的疫苗株。在根除天花運(yùn)動(SEC)中使用，2008年被Acambis生產(chǎn)的ACAM2000取代。它是作為小牛淋巴液的制劑生產(chǎn)的，將其冷凍干燥并用抗生素處理。

EM63：SEC中使用的俄羅斯毒株。

ACAM2000：Acambis生產(chǎn)的當(dāng)前在美國使用的菌株。 ACAM2000通過噬菌斑純化來自Dryvax病毒的克隆。它是在Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的。

改良安卡拉痘苗病毒(MVA)：一種高度減毒菌株，是通過在雞胚成纖維細(xì)胞中傳代牛痘病毒數(shù)百次而產(chǎn)生的。與某些其他痘苗病毒株不同，它不會使免疫缺陷小鼠生病，因此，由于年齡或感染HIV等原因，免疫系統(tǒng)較弱的人接種安卡拉株可能更安全。

LC16m8：日本開發(fā)并目前使用的減毒株

CV-1：在美國開發(fā)并在1960年代末至1970年代末在美國使用的減毒株

Western Reserve(WR，標(biāo)準(zhǔn)株)

Copenhagen(哥本哈根)

Connaught實驗室（加拿大）

附帶一提

? ? ? ? 痘苗病毒是唯一一個可以在生物安全等級2級(BSL-2)實驗室操縱的痘病毒。而其他的痘病毒生物安全等級至少為3級(BSL-3)，天花病毒(VARV，代表毒株為India-1967/Ind3，DNA長度為185578個堿基對)為4級(BSL-4)。

生物工程

? ? ? ? 由于痘苗病毒的基因組很大，非必需基因占總基因數(shù)的比例很大，因此痘苗病毒可以被生物工程改造成基因載體。但是，基因重組成功率不高，再加上痘病毒復(fù)制時會導(dǎo)致細(xì)胞裂解，因此痘苗病毒載體應(yīng)用率不高。

? ? ? ? 杜鵑：下期介紹的病毒是另一種痘病毒——口瘡病毒(Orf?Virus)。