科研利器 | 全外顯子測序技術(shù)的應(yīng)用！
人類完整基因組包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩個部分，其中編碼區(qū)又分為外顯子區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域。外顯子區(qū)域雖然只占到基因組的1-2%，但是包含了合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息，涵蓋了與個體表型相關(guān)的大部分功能性變異，大約85%的致病突變發(fā)生在人類基因組的蛋白編碼區(qū)。
全外顯子測序（WholeExome Sequencing，WES），即對基因組上的全部外顯子部分進行測序檢測，相對全基因組測序（WholeGenomeSequencing，WGS），檢測區(qū)域較小，更容易做到深度測序，可以顯著提高低頻突變和罕見變異的檢出率，同時可以降低檢測成本和壓縮數(shù)據(jù)空間。
全外顯子測序的關(guān)鍵步驟即對外顯子區(qū)域的捕獲。目前全外顯子測序的技術(shù)簡單高效，一般采用液相探針對外顯子區(qū)域進行靶向捕獲，經(jīng)過富集后再進行高通量測序。
全外顯子測序技術(shù)目前廣泛應(yīng)用在遺傳類疾病的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用中。對于已知類疾病，全外顯子的測序結(jié)果可以幫助醫(yī)生進行診斷和設(shè)計個性化的治療方案；對于未知類疾病，全外顯子測序可以幫助科學(xué)家對疾病的發(fā)病原理進行探索和調(diào)查。
在臨床應(yīng)用上，近年來，WES技術(shù)逐漸從兒科疾病及遺傳病的檢測邁入到產(chǎn)前診斷。在妊娠過程中，大約2%~4%的胎兒存在明顯的結(jié)構(gòu)異常，目前常用的染色體核型分析和染色體拷貝數(shù)分析技術(shù)只能為20%左右的這類胎兒提供診斷。產(chǎn)前全外顯子組測序可將結(jié)構(gòu)異常胎兒的診斷率提高8.5%~10%。
經(jīng)典案例分析全外顯子測序發(fā)現(xiàn)新的不孕癥致病基因
2016年復(fù)旦大學(xué)王磊團隊在NewEngland Journal of Medicine雜志發(fā)表題為“Mutationsin TUBB8 and Human Oocyte MeioticArrest”的文章，發(fā)現(xiàn)了單基因TUBB8的突變嚴重破壞了正常的微管行為并導(dǎo)致女性不孕癥，并揭示了TUBB8是參與人類卵母細胞減數(shù)分裂紡錘體組裝和成熟的關(guān)鍵基因[1]。
研究參與者：
來自24個家庭的卵母細胞成熟停滯患者
檢測平臺：
Illumina測序平臺
研究思路：
1.全外顯子測序和Sanger測序鎖定候選基因TUBB8
圖1.受卵母細胞阻滯影響的家族的譜系和TUBB8狀態(tài)
圖中顯示了7個具有遺傳或新的TUBB8突變的家族。方形表示男性家庭成員，圓形表示女性家庭成員，實心符號表示受影響的家庭成員，開放符號表示未受影響的家人。短的雙水平線表明沒有后代。箭頭表示家庭1和家庭2中的先證者。家庭1包括五名患有長期原發(fā)性不孕的受影響婦女。
TUBB8中的V229A突變是從每個受影響婦女的父親那里遺傳的。家庭成員IV-2是一名7歲女孩，攜帶該突變，無法評估其生育能力。D417N、M363T、R2K和M300I突變分別在家族2、5、6和7中鑒定；父系遺傳是明顯的。家族3和4中鑒定的S176L和R262Q突變是新的。Sanger測序色譜圖顯示在家系附近。W表示野生型。
表1.來自7個TUBB8突變家族的患者的臨床表現(xiàn)和回收卵母細胞的特征。
測序的結(jié)果確定了確定了一個四代家族（家族1），具有罕見的原發(fā)性女性不育常染色體顯性遺傳模式。對家族1的五個成員（三個不孕，兩個未受影響）進行的全外顯子測序分析表明，TUBB8編碼區(qū)存在一個單一突變，即雜合錯義c.T686C（p.V229A）突變，該基因編碼靈長類特異性β-微管蛋白同種型，其功能尚未確定。該突變與家族1中的女性不育共同分離，并以父系傳播為特征（圖1）。
研究者隨后在7名具有類似卵母細胞成熟停滯表型的不孕患者中發(fā)現(xiàn)了6個其他TUBB8突變：家族2中的2名患者（c.G1249A，p.D417N）、家族5中的1名患者（c.T1088C，p.M363T）、家族6中的1例患者（c.G5A，p.R2K）和家族7中的1位患者（c.G900A，p.M300I）（所有這些突變均為父系遺傳），以及家族3患者（c.C527T，p.S176L）和家族4患者（c.G785A，p.R262Q）中的新發(fā)突變（圖1）。
來自其他17個原發(fā)性不孕家庭的17名患者中未檢測到TUBB8突變。家庭2至7中的每個患者都進行了兩至五次失敗的IVF或胞漿內(nèi)精子注射嘗試。在這些嘗試中收獲的幾乎所有卵母細胞都在中期I被捕獲，沒有一個卵母細胞具有可見的紡錘體。
對家族1、2、3、4和6中患者的一個中期I卵母細胞進行免疫染色，發(fā)現(xiàn)異常紡錘體或無可檢測紡錘體（圖2C）。因此，所有患者都缺乏成熟的中期II卵母細胞。
圖2.發(fā)育停滯的卵母細胞表型
從顆粒細胞中分離出一個正常卵母細胞（圖A）和一個來自家族1先證者（圖B）的卵母細胞，并通過光鏡和偏光顯微鏡檢查。正常中期II（MII）卵母細胞有一個第一極體（圖a中的黑色箭頭），正常中期I（MI）和MII卵母細胞具有可見紡錘體（圖B中的白色箭頭）?；颊叩乃新涯讣毎幱贛I狀態(tài)，沒有一個卵母細胞具有第一極體（圖B）（補充附錄中的圖S1）。
家族1（圖B）和家族2和6（補充附錄中的圖S1）患者的卵母細胞沒有可見紡錘體（沒有獲得家族3患者卵母細胞的偏振顯微鏡數(shù)據(jù)）。在圖B中的偏振顯微圖像中，紅色表示輸入光信號的內(nèi)反射；對于患者卵母細胞的可視化，使用最高可能的輸入強度來排除存在任何紡錘體的可能性。正常卵母細胞和受影響家庭成員的卵母細胞（圖C）用抗β-微管蛋白抗體免疫標(biāo)記，以觀察紡錘體（綠色），并用Hoechst33342復(fù)染，以觀察DNA（藍色）。
2.突變型TUBB8破壞了正常的微管行為
圖3.野生型和突變型TUB8對HeLa細胞微管的影響
HeLa細胞用工程化表達C-末端FLAG標(biāo)記的TUBB8（野生型和突變型）的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。圖A顯示了用FLAG表位抗體進行免疫染色以檢測轉(zhuǎn)基因表達的結(jié)果（綠色）和用α-微管蛋白抗體進行免疫著色以檢測內(nèi)源性微管網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果（紅色）。
所示為表達各種轉(zhuǎn)基因的細胞的實例，其中微管組裝成正?；虍惓５拈g期網(wǎng)絡(luò)或微管網(wǎng)絡(luò)完全閉塞；在后一種細胞中，F(xiàn)LAG標(biāo)記在整個細胞質(zhì)中表現(xiàn)為彌漫、斑駁的圖案。條形圖表示10μm。圖B顯示了圖a中所示微管表型的定量分析。
突變體TUBB8的低表達通常與正常表型相關(guān)，而突變體TUB88的中高表達通常與異常和消失表型相關(guān)。在三個單獨的實驗中，分別檢測了約200個表達野生型或突變型TUBB8的轉(zhuǎn)染細胞。顯示了分配給每個表型類別（正常、異?；蛳У奈⒐芫W(wǎng)絡(luò)）的細胞的平均百分比；I條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
閉塞表型與預(yù)測干擾異二聚體穩(wěn)定性、β-微管蛋白折疊或聚合的突變（V229A、S176L、M363T、R2K和M300I）最密切相關(guān)，而預(yù)測干擾驅(qū)動蛋白結(jié)合的突變（R262Q和D417N）導(dǎo)致微管組織發(fā)生改變（圖3B）。
圖4.小鼠和人類卵母細胞中突變的TUB8RNA
圖A顯示了注射突變RNA的小鼠卵母細胞的極體擠出率，與野生型對照組的極體擠壓率相比。在三次實驗中，突變RNA的小鼠的比率（顯示為比率的平均值）顯著降低。T形條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。與野生型卵母細胞相比，單星號表示P<0.01，雙星號表示P<0.001；P值基于未配對t檢驗。圖B和C顯示了在生發(fā)泡破裂12小時（小鼠）和16小時（人類）后，用編碼野生型或突變型（S176L或D417N）TUBB8的RNA顯微注射的小鼠（圖B）和人類（圖C）卵母細胞的免疫染色。MI卵母細胞用Hoechst33342染色以顯示染色體（藍色），β-微管蛋白染色以顯示紡錘體（綠色），F(xiàn)LAG染色以顯示TUB8（紅色）。
研究者使用更高濃度的野生型S176L和D417NTUBB8 RNA（1000ng/ml）重復(fù)這些實驗。較高的濃度導(dǎo)致兩種突變RNA的紡錘體組裝嚴重或完全受損（圖4B）：人類卵母細胞成熟停滯的表型。
研究者還通過向小鼠卵母細胞顯微注射編碼野生型或突變型（S176L、R262Q或M363T）TUBB5的RNA，測試了微管蛋白同種型背景對這些效應(yīng)的貢獻程度，用野生型或突變的TUBB5RNA顯微注射的卵母細胞具有具有正常形態(tài)學(xué)特征的紡錘體。
這一結(jié)果表明，觀察到的受損紡錘體組裝的表型是由TUBB8同種型背景下的突變賦予的。為了進一步驗證TUB8突變的影響，研究者將TUBB8S176L和D417N突變的RNA微注射到人生發(fā)泡卵母細胞中；觀察到嚴重或完全受損的紡錘體組裝（圖4C），這一發(fā)現(xiàn)與以相同方式處理的小鼠卵母細胞的表型一致。
從這些觀察中得出結(jié)論，TUBB8的突變導(dǎo)致卵母細胞成熟停滯，并且TUBB8在人類卵母細胞的減數(shù)分裂紡錘體組裝和成熟中起關(guān)鍵作用。
引用文獻：
1.Feng R, Sang Q, Kuang Y, Sun X, Yan Z, Zhang S, Shi J, Tian G,Luchniak A, Fukuda Y, Li B, Yu M, Chen J, Xu Y, Guo L, Qu R, Wang X,Sun Z, Liu M, Shi H, Wang H, Feng Y, Shao R, Chai R, Li Q, Xing Q,Zhang R, Nogales E, Jin L, He L, Gupta ML Jr, Cowan NJ, Wang L.Mutations in TUBB8 and Human Oocyte Meiotic Arrest. N Engl J Med.2016 Jan 21;374(3):223-32. doi: 10.1056/NEJMoa1510791. PMID:26789871; PMCID: PMC4767273.
