前言

肺癌在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和死亡率。在所有肺癌中，大約80％–85％是非小細胞肺癌（NSCLC）。程序性死亡1（PD-1）抑制劑及其配體PD-L1是缺乏敏感性EGFR或ALK突變的轉(zhuǎn)移性NSCLC的有效療法。然而，即使將這些生物標記物用作金標準，其緩解率（< 25％）仍然不能令人滿意，甚至導致過度進展性疾?。℉PD）。因此，仍然需要針對大多數(shù)晚期NSCLC患者和更有效的一線治療方法，以尋找可從中受益的患者。

目前世界范圍內(nèi)已經(jīng)進行了廣泛的研究，以確定PD-1 / PD-L1途徑抑制劑與其他治療藥物或具有免疫調(diào)節(jié)作用的藥物的新組合，這些藥物或免疫調(diào)節(jié)作用可能會增強抗腫瘤反應。最近，腸道菌群激發(fā)了人們對癌癥免疫治療的極大熱情 。已顯示在臨床前腫瘤模型和癌癥患者中對癌癥免疫治療均具有良好的反應。因此，提出了調(diào)節(jié)腸道菌群的策略來治療癌癥患者，并作為新的反應預測生物標記物。

2021年5月澳門科技大學聯(lián)合中山大學及澳門鏡湖醫(yī)院的研究團隊在GUT發(fā)表的題為 “Ginseng polysaccharides alter the gut microbiota and kynurenine/tryptophan ratio, potentiating the antitumour effect of antiprogrammed cell death 1/ programmed cell death ligand1 (anti-PD- 1/PD-L1) immunotherapy”的研究成果，通過16S+代謝組學研究方法，發(fā)現(xiàn)了人參多糖改變腸道菌群和犬尿氨酸/色氨酸比例，增強抗程序性細胞死亡1 /程序性細胞死亡配體1（anti-PD-1 / PD-L1）免疫療法的抗腫瘤作用。

中文標題：人參多糖改變腸道菌群和犬尿氨酸/色氨酸比例，增強抗程序性細胞死亡1 /程序性細胞死亡配體1（anti-PD-1 / PD-L1）免疫療法的抗腫瘤作用

研究對象：小鼠模型+體外實驗+臨床研究

發(fā)表期刊：GUT

影響因子：23.059

運用生物技術：16S基因測序、代謝組學

研究背景

人參已經(jīng)在亞洲廣泛使用了數(shù)千年，不僅作為藥物而且還作為膳食補充劑。長期服用人參提取物已顯示出可通過增加雙歧桿菌，乳桿菌，梭狀芽孢桿菌等的豐度來調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群。人參包含許多活性成分，包括人參皂苷，精油，肽聚糖，多糖，含氮化合物，脂肪酸和酚類化合物。

PD-1 / PD-L1免疫療法有望用于晚期肺癌治療，但應答率有待提高。腸道菌群在免疫療法致敏中起關鍵作用，人參已顯示具有免疫調(diào)節(jié)潛力。在這項研究中，研究人員旨在研究人參多糖（GPs）和αPD-1單克隆抗體（mAb）的聯(lián)合治療是否可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群來敏化應答。

研究思路

研究結果

聯(lián)合治療使α-PD1單抗在荷瘤小鼠模型中的抗腫瘤效應敏感

為了研究GP是否可以增強αPD-1mAb的抗腫瘤作用，研究人員首先評估了接種了LLC（路易斯肺癌細胞）的C57 BL/6J小鼠的腫瘤生長過程。分別在腫瘤接種后第0天和第9天開始對小鼠進行GP灌胃和αPD-1mAb注射（圖1A）。最初通過腫瘤體積和腫瘤重量評估其抗腫瘤作用（圖1B，C）。聯(lián)合治療后，傳統(tǒng)的帶有LLC的小鼠表現(xiàn)出對αPD-1mAb的增強反應并降低了腫瘤進展（在線補充圖1A）。在第24天，與單獨的媒介物治療組和αPD-1mAb治療組相比，聯(lián)合治療組分別表現(xiàn)出75.2％和65.1％的腫瘤生長抑制。相應地，小鼠的存活期顯著延長（圖1D）。這些結果表明，聯(lián)合治療可改善帶有LLC的小鼠中αPD-1mAb的抗腫瘤作用。研究人員還在具有LLC細胞的HuPD-1小鼠（圖1E，F(xiàn)）和B16-F10荷瘤的小鼠（在線補充圖1B，C）中觀察到了這種增強的抗腫瘤作用。

圖1 | GPs在傳統(tǒng)和人源化PD-1敲入（HuPD-1）LLC小鼠中增強了αPD-1mAb的抗腫瘤作用。

（A）經(jīng)GP+αPD-1mAb聯(lián)合治療LLC小鼠的示意圖。

（B）每組的腫瘤生長曲線。常規(guī)C57 BL/6J小鼠在腫瘤接種后第0天接受GP注射，并在第9天腹膜內(nèi)注射αPD-1mAb。

（C）常規(guī)LLC荷瘤小鼠的腫瘤重量。

（D）常規(guī)LLC小鼠的生存曲線。

（E）在攜帶huPD-1敲入LLC的每組小鼠模型中的腫瘤生長曲線。

（F）HuPD-1敲入的荷瘤小鼠的腫瘤重量。數(shù)據(jù)代表一個或三個獨立實驗，每組n = 5-10。誤差棒代表平均值±SEM。通過具有Sidak校正的雙向ANOVA評估腫瘤生長曲線。通過單向方差分析評估腫瘤重量。對生存數(shù)據(jù)進行對數(shù)秩（Mantel-Cox）測試。?* p＜0.05，** p ＜0.01，*** p ＜0.001。GP，人參多糖；LLC，Lewis肺癌；mAb，單克隆抗體；PD-1，程序性死亡1。

?聯(lián)合療法的體內(nèi)抗腫瘤作用與免疫力的提高有關

為了確定聯(lián)合療法對免疫系統(tǒng)的影響，?進行了組合療法治療后，細胞毒性CD8 + T細胞數(shù)量增加，而Treg細胞數(shù)量減少。在帶有LLC的小鼠中，接種腫瘤24天后，小鼠用αPD-1mAb，GP或GP和αPD-1mAb聯(lián)合治療。研究人員使用流式細胞儀分析了外周血，脾臟和腫瘤組織的免疫學變化。研究人員觀察到，與單獨的αPD-1mAb組相比，聯(lián)合組的CD8 +?/ CD4 +比在外周（血液和脾臟組織）和腫瘤組織中均增加（圖2A）。在外周和腫瘤組織中，CD8 + T細胞中功能性細胞因子，IFN-γ，TNF-α和GZMB的產(chǎn)生也均增加（圖2B–D），（在線補充圖2），表明了該藥物組合的有益作用。

圖2 | 分析血液，脾臟和腫瘤中的免疫細胞變化。

（A-E）CD8 +?/ CD4 + T細胞比率，血液，脾臟和腫瘤組織中CD8 + T細胞和FOXP3 CD4 + T細胞中IFN-γ，TNF-α，顆粒酶B（GZMB）的表達。

（F）放大400倍時腫瘤組織中CD4，CD8，IFN-γ，TNF-α和GZMB的代表性IHC譜圖。

（G–K）定量分析，GP，人參多糖；IFN-γ，干擾素-γ；IHC，免疫組化；LLC，Lewis肺癌；mAb，單克隆抗體；TNF-α，腫瘤壞死因子-α；Treg，調(diào)節(jié)性T細胞。

研究人員還觀察到外周和腫瘤組織中FoxP3?+調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞的下調(diào)（圖2E），而IHC譜在腫瘤組織中得到了一致的結果（圖2F–K），這些結果表明聯(lián)合治療可能通過激活CD8 + T細胞并抑制Tregs的功能。

調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）是免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的主要參與者，通常與不良的預后和生存率相關。臨床研究已經(jīng)確定了一組患者，這些患者可能因抗PD-1治療而導致癌癥的HPD（高度進展性疾?。╋L險增加。在研究人員的研究中，GP與αPD-1mAb聯(lián)合使用可減少外周和腫瘤中FoxP3 + Treg的比例，這可能有助于預防HPD。總而言之，這些數(shù)據(jù)表明聯(lián)合治療具有增強的抗腫瘤免疫作用。

聯(lián)合療法可防止腸道菌群失調(diào)

為了研究口服GPs是否會改變腸道菌群，研究人員對所有治療組的糞便樣本進行了16S rRNA測序。與單獨使用αPD-1mAb的組相比，聯(lián)合治療后，微生物組成發(fā)生了變化，Muribaculum的豐度顯著增加（圖3A，B）。當與GP和空白對照組進行比較時，研究人員還觀察到了Muribaculaceae的增加（在線補充圖3），這表明GP可能具有豐富Muribaculaceae豐度的潛力。

為了進一步闡明腸道菌群與抗腫瘤作用之間的因果關系，研究人員評估了用抗生素治療的帶有LLC的小鼠的腫瘤生長，發(fā)現(xiàn)抗生素治療損害了抗腫瘤功效（圖3C，D）。在維持腸道免疫力方面，對結腸的組織病理學評估表明，聯(lián)合治療可減少結腸中炎性細胞的浸潤（圖3E，F(xiàn)）。IEL在維持屏障功能和降低對感染和免疫病理的敏感性中起著至關重要的作用。

為了研究聯(lián)合治療是否會影響IEL，研究人員采用了RNA測序技術來檢查小腸中IEL的轉(zhuǎn)錄組變化。與單獨使用αPD-1mAb的組相比，上皮內(nèi)保護基因（CLCA3，Zg16，Pla2g10，Agr2，Guca2a和Tff3），28-30個與代謝相關的基因（Dgat2和Ces2a）和S100A6在聯(lián)合治療組的表達顯著上調(diào)。相反，免疫球蛋白可變區(qū)重鏈基因（Ighv1-64，Ighv6-6，Ighv5-4，Ighv1-55，Ighv1-50和Ighv1-26），免疫球蛋白可變區(qū)輕鏈基因（Iglv2），免疫球蛋白κ可變表達在用聯(lián)合療法治療的小鼠的IEL中，基因（Igkv4-68），Lrrk2，Camsap2，Myo5a，Bmf，Slc29a3和Mios被下調(diào)（圖3G）?；虮倔w論（GO）分析表明，這些差異表達的基因主要與溶酶體，分泌顆粒和能量代謝有關，可以保護腸屏障的完整性（圖3H）。與單純使用GP組比較時，研究人員觀察到了聯(lián)合組的免疫應答相關的基因被上調(diào)（圖?3I ，J?）。

圖3 | 聯(lián)合治療可通過調(diào)節(jié)腸道菌群和增強腸道免疫力來維持腸道穩(wěn)態(tài)。

（A）不同治療組中前15個屬的相對豐度。

（B）對αPD-1mAb與聯(lián)合治療組之間檢測到的差異豐富的分類單元進行LEfSe分析。

（C）腫瘤接種后第9天，組合治療的四組腫瘤的生長曲線

（D）ABX處理的荷瘤小鼠的腫瘤重量。

（G，H）熱圖顯示了αPD-1與聯(lián)合治療組組之間以及GP與聯(lián)合治療組組之間的小腸IEL中的差異基因和基因本體（GO）功能分析。

（I，J）熱圖顯示GP與聯(lián)合治療組組之間以及GP與聯(lián)合治療組之間的小腸IEL中的差異基因和GO功能分析。

聯(lián)合治療可增加SCFA豐度并異常調(diào)節(jié)吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）活性

聯(lián)合治療后，SCFA的豐度增加，IDO活性降低。為了研究SCFA的作用，研究人員使用超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC / MS）代謝組學檢測了動物血漿中SCFA（乙酸，丙酸，丁酸，異丁酸，戊酸，異戊酸和己酸）的產(chǎn)生。有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)，除乙酸外，用αPD-1mAb處理后，所有SCFA的豐度都增加了。值得注意的是，與單獨使用αPD-1mAb的治療組相比，聯(lián)合治療組的戊酸豐富度顯著增加（圖4A–G）。聯(lián)合治療可增加SCFA豐度并異常調(diào)節(jié)吲哚胺 2,3-?雙加氧酶（ IDO ）活性。

圖4 | 運用代謝組學檢測血漿中的SCFA，脂肪酸和氨基酸

（A-G）攜帶LLC的模型小鼠中SCFA的相對豐度，包括乙酸，丙酸，丁酸，異丁酸，戊酸，異戊酸和己酸。

（H–J）L-犬尿氨酸，L-色氨酸和犬尿氨酸/色氨酸的相對峰面積。

（K）IDO在LLC腫瘤組織中的代表性IHC譜圖。

除了?SCFA，研究人員還測量了?52?種氨基酸和脂肪酸代謝物的變化（在線補充圖?4A）。并且觀察到，與PD-1 mAb 單獨治療組相比，聯(lián)合治療組中 L-犬尿氨酸和 Kyn/Trp 比值（表示為 IDO 活性）顯著降低，色氨酸代謝在這些代謝物中的貢獻最大，但 L-色氨酸沒有（在線補充文件4A–D，圖4H-J)。結果表明聯(lián)合治療可能與 IDO 活性有關。

為了進一步研究腫瘤組織中的?IDO?活性，研究人員進了?IHC?染色，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組中?IDO?的表達下調(diào)（圖4K）。為了確定GPs對腸道微生物中色氨酸代謝的影響，通過體外分批發(fā)酵系統(tǒng)對GPs進行人糞便樣品的元發(fā)酵。有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)在好氧和厭氧發(fā)酵條件下，GPs 顯著增加 L-色氨酸的產(chǎn)量并降低 L-犬尿氨酸的產(chǎn)量和犬尿氨酸/色氨酸的比例（在線補充表?1），表明 GPs 可以影響通過腸道微生物進行色氨酸代謝。

圖5 | 通過16S rRNA基因測序?qū)鹫撸≧s）和非應答者（NRs）之間腸道菌群多樣性的比較

（A）Rs（n = 10）和NRs （n = 6）組中的Shannon指數(shù)。

（B）在物種級別上相對于每個組，排名前10位的相對豐度直方圖。

（C）LEfSe分析用于在使用派姆單抗治療之前在Rs和NRs之間檢測到的差異豐富的分類單元。

帕博利珠單抗治療的NSCLC應答者和非應答者中腸道菌群組成存在明顯的區(qū)別

臨床研究中納入了16名中國NSCLC患者，并接受了抗PD-1阻斷劑治療。其中十名患者被澳門江湖醫(yī)院的醫(yī)師評估為有反應者（Rs），六名為無反應者（NRs）。這些患者的臨床病理特征列在在線補充表2中。所有患者均接受了30個月以上的隨訪，并通過CT掃描監(jiān)測其反應狀態(tài)（在線補充圖5A–C）。

為了研究腸道微生物組的組成是否與抗PD-1免疫療法有關，研究人員收集了糞便基線樣本，并對其進行了16S rRNA測序。腸道微生物組的α多樣性表明Rs的豐富度和均勻度高于NRs（圖5A）。在物種水平上，研究人員觀察到Bacteroides vulgatus的相對豐度在Rs中居首位，并且三種腸道微生物的含量也過高：parabacteroidesdistasonis（p = 0.04），bacterium LF-3（p = 0.02）和Sutterella wadsworthensis HGA0223（p = 0.09；圖5B–G，（在線補充文件5D–G）。有趣的是，對于那些具有更好響應和生存率的患者，這些細菌的豐度有所增加。

GP恢復了非Rs糞便移植的LLC荷瘤小鼠中對αPD-1mAb治療的反應

在研究人員的初始研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)GP增強了LLC荷瘤小鼠中αPD-1mAb的抗腫瘤作用。GP是否可以逆轉(zhuǎn)人類對αPD-1mAb治療的反應尚不清楚；因此，研究人員設計了一個FMT實驗來對其進行研究。將來自六個NRs的糞便微生物群轉(zhuǎn)移到GF小鼠中。定居后，將LLC腫瘤細胞接種到小鼠中。然后，使用之前的小鼠操作方案治療小鼠（圖6A）。正如預期的那樣，類似于NsR，研究人員發(fā)現(xiàn)小鼠對αPD-1mAb治療具有抗性。有趣的是，當小鼠用GP加αPD-1mAb進行治療時，反應得以恢復。聯(lián)合治療顯著延遲了腫瘤的生長（圖6B）。流式細胞儀分析和IHC分析表明，血液和腫瘤中CD8 + T細胞的CD8 +?/ CD4 +T細胞比例以及IFN-γ，TNF-α和GZMB的產(chǎn)生均增加（圖6C–F，H–M?）。研究人員還觀察到聯(lián)合治療組中的Treg細胞更少，這與治療功效的改善相關（圖6G）。同時，研究人員測定了小鼠血漿中色氨酸和犬尿氨酸的含量，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理后Kyn / Trp比值降低（圖6J）。一致地，研究人員還觀察到聯(lián)合治療后腫瘤組織中IDO的表達較低（圖6K，L）。總體而言，這些數(shù)據(jù)表明 GP 可以使 LLC 小鼠中對?αPD-1mAb 的反應敏感。

圖6 | GP恢復了從無反應者移植了微生物群的LLC荷瘤小鼠對αPD-1mAb的反應。

同樣，研究人員檢查了聯(lián)合治療是否可以調(diào)節(jié)移植了NRs腸道菌群的LLC荷瘤小鼠的腸道菌群。令人興奮的是，與αPD-1mAb和空白對照組相比，在聯(lián)合治療組組中，Bacteroides的豐富度，尤其是B. vulgatus和 P. distasonis中的含量顯著增加（圖6M，O，在線補充文件6A–C）。通過16S rRNA測序（在線補充文件7A–B）沒有發(fā)現(xiàn)GF培養(yǎng)條件下的細菌污染，這些結果表明，聯(lián)合處理可能會使NRs的腸道菌群重塑至Rs，從而增強對αPD的反應。

討論

圖7 | GPs與αPD-1mAb結合可通過恢復腸道菌群來提高應答率。

圖7（A）GPs通過增強CD8 T細胞功能，增加IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生以及降低Treg在循環(huán)系統(tǒng)中的抑制作用來增強αPD-1mAb的抗腫瘤作用，這可以通過重塑腸道菌群來解決因此會影響色氨酸的代謝和SCFA。聯(lián)合處理可增加含LLC小鼠的Muribaculum的豐度。聯(lián)合治療上調(diào)了CLCA3，TFF3，AGR2，Zg16，Pla2g10和Guca2a等上皮保護基因的表達。代謝產(chǎn)物SFCA和犬尿氨酸進入血液循環(huán)系統(tǒng)并增強免疫功能，從而抑制了腫瘤的生長并延長了生存期。

圖7（B）聯(lián)合療法恢復了腸道菌群，這有助于將腸道菌群從無反應者恢復為反應者，從而增強了對αPD-1mAb的反應。通過16S rRNA測序發(fā)現(xiàn)，對pembrolizumab的應答者中，Parabacteroidesdistasonis和Bacteroides vulgatus含量較高。當通過糞便微生物群移植（FMT）將腸道微生物群從無反應者移植到無菌小鼠中，然后在定殖后接種LLC腫瘤細胞時，對小鼠進行聯(lián)合治療。

與αPD-1mAb和對照空白組相比，通過16S rRNA測序在組合組中發(fā)現(xiàn)了豐富的Parabacteroides distasonis和Bacteroides vulgatus。同時，聯(lián)合療法通過增強CD8 + T細胞的功能，增加IFN-γ，TNF-α和顆粒酶B的產(chǎn)生并減少Treg細胞來顯著抑制腫瘤的生長。GP，人參多糖；IFN-γ，干擾素-γ；LLC，Lewis肺癌；mAb，單克隆抗體；IHC，免疫組化；NR，無響應；SFCA，短鏈脂肪酸；TNF-α，腫瘤壞死因子-α。總之，研究人員發(fā)現(xiàn)GP通過增強CD8 + T細胞功能和降低Treg的抑制作用來增強αPD-1mAb的抗腫瘤作用，這可能通過重塑腸道菌群和色氨酸代謝來解決，以提高免疫療法的療效。

研究討論

研究人員發(fā)現(xiàn)GPs通過增加微生物代謝產(chǎn)物戊酸和降低L-犬尿氨酸以及Kyn / Trp的比例來增加對αPD-1mAb的抗腫瘤反應，這有助于抑制調(diào)節(jié)性T細胞并在誘導后Teff細胞誘導聯(lián)合治療。此外，微生物分析表明，在臨床上對PD-1阻滯劑的響應者中，和的含量高于未響應者。此外，聯(lián)合療法通過將腸道菌群從無反應者重塑成有反應者而使從六只無反應者接受FMT的小鼠對PD-1抑制劑的反應敏感。因此，研究人員認為，GPs聯(lián)合αPD-1mAb可能是使非小細胞肺癌患者對PD-1免疫治療敏感的一種新策略。而腸道菌群可以用作預測抗PD-1免疫療法反應的新型生物標志物。

小鹿推薦

本文研究人員通過糞便微生物菌群移植（FMT）和16S rRNA基因測序評估聯(lián)合治療對腸道菌群的抗腫瘤敏化作用。為了評估免疫相關的代謝產(chǎn)物，對血漿樣品進行了代謝組學分析。?結合16S+代謝組學分析技術方法進行整體評估了 GPs聯(lián)合αPD-1mAb療法對于治療非小細胞肺癌的前景！

1.Britton GJ, Contijoch EJ, Mogno I, et al. Microbiotas from humans with inflammatory bowel disease alter the balance of gut Th17 and ROR?t R?t+ regulatory T cells and exacerbate colitis in mice. Immunity 2019;50:212–24.

2. Nishitsuji K, Xiao J, Nagatomo R, et al. Analysis of the gut microbiome and plasma short-chain fatty acid profiles in a spontaneous mouse model of metabolic syndrome.Sci Rep 2017;7:15876.

3. Graf J, Ledala N, Caimano MJ, et al. High-resolution differentiation of enteric bacteria in premature infant fecal Microbiomes using a novel rRNA amplicon. mBio 2021;12. doi:10.1128/mBio.03656-20. [Epub ahead of print: 16 Feb 2021].

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